注3：测荧光强度时，为排除背景的干扰，校正R＝（F340-Fb） / （F380-Fb）。其中，Fb是细胞背景的荧光强度，Simple PCI软件可直接扣除背景的荧光强度，计算校正后的R值。

二、校正Rmin、Rmax和β值。

方法：利用体内校正Kd的Rmin、Rmax和β值。

三、Fura-2/ AM负载入细胞

1.     小心取出培养有细胞的培养皿，用负载溶液I轻轻漂洗3次；生长面朝上，在上面分别滴加负载溶液II（Fura-2/ AM染液的终浓度为2ug/ml）；

2.     将细胞放置于37℃细胞培养箱中，避光负载20-30min，

3.     用负载溶液I冲洗细胞1-3次，将细胞放置在37℃(25度或室温)下避光孵育， 20-30min。制片，待检。

4. 结合Calcium Fura-2检测参数：Ex=340nm, Em=510 nm；游离Fura-2检测参数：Ex=380nm, Em=510nm。

注1：具体操作可结合实际给药操作，适当调整。

注2：负载用的细胞培养皿，经多聚赖氨酸处理有利于细胞贴壁和生长。

    多聚赖氨酸处理的步骤：将无菌的浓度为1mg/ml的多聚赖氨酸Tris缓冲溶液（0.15mol/L,PH 8.4）约0.25ml滴在洁净无菌的培养皿底部过夜，使多聚赖氨酸粘附在培养皿底部。第二天吸去多余的多聚赖氨酸溶液，依次经去离子水、Tyrode溶液和去离子水浸洗两次。空气干燥并用紫外光照射15分钟后即可使用。

四、Fura-2/AM负载培养细胞的瞬间胞内钙动态变化的测量

将待检样品放在显微镜载物台上观察，通过Hamamatsu钙离子检测系统（Hamamatsu AG CCD+SimplePCI软件系统+Zeiss Axiovert200倒置荧光显微镜）进行实时监测测定。在相同的环境下（同一光学系统、同一温度、恒定的曝光时间等）340nm和380nm间激发成像，测定一定时间序列胞内钙离子的荧光强度F340、F380、Ratio和钙离子浓度的变化。

注：1. R值也是校正后的Ratio＝（F340-Fb） / （F380-Fb）。

    2. 先测静息状态的钙离子浓度，待其值稳定后，可对给药细胞检测钙离子的浓度变化情况。

五.成像系统实时检测过程与数据处理

1）  通过软件设置CCD、DG-4的控制参数：设定340nm、380nm滤光片自动切换时间、曝光时间等。

2）  在电脑上成像后，建立背景ROI，计算背景光密度值Fb以扣除背景。

3）  通过软件自动识别细胞样品，建立样品ROI区域。

4）  自定义计算参数F340、F380、R= （F340-Fb） / （F380-Fb）、[Ca 2+]i =KD x ß x (R -Rmin)/(Rmax- R)。

实时输出细胞340/380nm的荧光光密度比率变化曲线图和游离Ca2++的浓度变化曲线图 ，并存储数据。

仪器功能扩展：

利用现有的钙离子系统，仅需针对图中所列荧光染料选配相应的滤光片组，就可以满足多种成像需求，达到系统功能扩展。