分光光度技术是利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，从而对物质进行定性、定量分析和结构分析的方法。使用的仪器称为分光光度计，具有灵敏度高、测定速度快、应用范围广的特点。其中，紫外/可见分光光度技术是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用。

基本原理

光是电磁波，可用波长“λ”表示。电磁波谱由不同性质的连续波长的光谱组成。对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。光的波长是相邻两个波峰之间的距离。光的传播由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”构成。波长、光速和频率的关系为：λ = C/ν，其中C为光速，ν为频率。光也可看作由具有能量的粒子组成，粒子能量E = h·ν，h为普朗克常数（6.624×10⁻²⁷ erg·s）。

紫外区可分为近紫外（200-400 nm）和真空紫外（<200 nm）。由于吸收池和光学元件以及氧气能吸收小于190 nm波长的光，常规紫外测定集中在近紫外区。可见光区为400-800 nm。组成物质的分子处于一定能态并不断运动，分子运动包括平动、转动、振动和电子运动，每种运动状态都处于一定的能级。分子能量可表示为：E = E₀ + E平 + E转 + E振 + E电。与光谱相关的能量变化是分子的转动、振动和电子能量。分子吸收能量跃迁到激发态时产生吸收光谱。分子转动、振动和电子能级的跃迁分别产生转动、振动和电子光谱。

根据量子力学原理，分子能态按规律跳跃式变化。物质吸收光时，能量增加不连续，只能吸收特定能量的光，吸收光的频率与能级差满足E = E₂ - E₁ = hν。能级差越大，吸收光频率越高（波长越短）。由于吸收不连续，在光谱的一定部位出现吸收暗带。分子转动能级差小（<0.05 eV），吸收出现在远红外或微波区；振动能级差较大（0.05-1.0 eV），吸收出现在中红外区；电子能级差更大（1-20 eV），吸收出现在可见、紫外或更短波长区。

可见光、紫外光吸收光谱由分子中价电子被激发跃迁形成。与吸收光谱相关的三种电子是：σ电子（形成单键）、π电子（形成双键）和n电子（未共享成键电子）。电子跃迁所需能量顺序为：n→π* < π→π* ≤ n→σ* < π→σ* < σ→π* < σ→σ*。紫外吸收光谱主要由双键电子（尤其是共轭双键中的π电子）和未共享电子对的激发产生。不同物质对紫外光的吸收性质取决于双键数目和共轭情况。

电子跃迁类型与紫外吸收波长关系如下：σ→σ*（C-H）100-150 nm；π→π*（非共轭，C=O）<200 nm；π→π*（共轭，=C-C=）200-300 nm；n→π*（C=O）~300 nm。π→π*跃迁所需能量较小，吸收在200-300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生。氨基酸、蛋白质与核酸含有大量共轭双键，因此200-300 nm的紫外吸收测定在生化实验中有广泛用途。

逐渐改变入射光波长，测定物质对各波长光的吸收程度（吸光度A或透光度T），以波长为横坐标、A或T为纵坐标，得到吸收光谱曲线。吸收光谱的特征包括：最大吸收峰（λmax）、最小吸收（λmin）、肩峰和末端吸收。λmax是化合物电子能级跃迁的特征波长，不同物质有不同的λmax，是定性鉴定的重要依据。吸收光谱的形状取决于物质结构，可与标准图谱对照进行定性分析。常用标准图谱有“Sadtler”紫外标准图谱集。由于紫外吸收峰较少且宽，定性时需结合红外光谱。

发色团：能引起n→π*、π→π*、n→σ*等电子跃迁的基团，如C=C、C=O等。助色团：具有非共价键的基团（如OH、NH₂、SH），与发色团连接时使吸收带向长波移动（红移），强度增加；若产生n→π*跃迁，则使吸收波长向短波移动（蓝移）。增色效应：核酸变性或降解导致DNA/RNA溶液对紫外光吸收明显增加（ε值升高），通常在260 nm测量。减色效应：变性核酸复性时ε值降低，紫外吸收显著降低，也在260 nm测量。

光吸收定律

朗伯-比尔定律：A = -lgT = ε b C，其中A为吸光度（光密度O.D），T为透光度（T = I/I₀），ε为摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹），b为光程（cm），C为样品浓度（mol/L）。吸光度A与ε和C成正比。ε是物质对某波长光吸收能力的量度，ε越大，灵敏度越高。通常ε > 10⁴为强吸收，ε = 10³-10⁴为较强吸收，ε < 10²为弱吸收。当b=1 cm、ε=10⁵时，可检测的最小浓度为10⁻⁸ mol/L。常用百分吸光系数E¹%₁cm,λmax，即浓度为1%（W/V）、b=1 cm时的吸光度。ε与E¹%₁cm,λmax的换算关系为：ε = E¹%₁cm,λmax × 分子量 / 10。

吸光度具有加和性：A = ε₁C₁b₁ + ε₂C₂b₂ + ...，即混合物总吸光度等于各组分吸光度之和，这是多元混合物定量分析的基础。例如，在离子交换柱层析分离核苷酸实验中，可利用吸光度计算回收率：回收率 = (A₂/A₁) × 100%。

例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1 cm石英吸收池测定260 nm处吸光度为0.650，纯溶剂吸光度为0.070，已知ε = 8.2×10³ M⁻¹cm⁻¹，计算摩尔浓度。解：A = 0.650 - 0.070 = 0.580，b=1 cm，C = A/(εb) = 0.580/(8.2×10³×1) = 7.1×10⁻⁵ mol/L。

例二：1%（W/V）酪氨酸酶溶液吸光度为24.9（1 cm，280 nm），计算A₂₈₀=0.250的酪氨酸酶溶液浓度。解：E¹%₁cm,₂₈₀ = 24.9，C未知 = (A未知/A已知) × C已知 = (0.250/24.9) × 1% = 0.01% = 0.1 mg/ml。

分光光度计的组成和构造

各种紫外/可见分光光度计基本由五部分组成：光源、单色器（包括光学系统）、样品室、检测器和显示装置。

光源：理想光源需提供连续辐射、光强度足够、光谱稳定、范围宽、寿命长。可见光和近红外光区使用钨灯或卤钨灯（320-1100 nm），紫外光区使用氘灯（195-400 nm）。氘灯寿命有限（约500小时），需节约使用。

单色器：分光光度计的核心，将混合光分解为单色光。主要部件包括入射狭缝、色散元件（棱镜或光栅）、准直镜和出射狭缝。光栅有反射光栅和全息光栅。全息光栅用激光全息照相法刻制，几乎没有“鬼线”，杂散光少，分辨率高。狭缝宽度影响光谱带宽和分辨率。光谱有效频带宽度b'与狭缝宽度b成正比，与线色散率成反比。分辨率R = λ/Δλ，狭缝越小，分辨率越高。

样品室：包括池架和吸收池（比色杯）。吸收池有光学玻璃杯（400-2000 nm）和石英玻璃杯（180-3000 nm）。常用1 cm池（容积3 ml）。使用注意事项：彻底清洗，避免指纹触摸透光面，禁止加热烘烤，需校正吸收池。

检测器：将光强度转换为电信号。常用光电管、光电倍增管和光电二极管。光电倍增管灵敏度高（比光电管高200倍），可检测弱光。光电二极管稳定性好、寿命长，二极管阵列分光光度计可实现快速全波段扫描（约10 ms），适用于动力学测定和高效液相色谱检测。

显示装置：现代分光光度计多连接微机，带有液晶或CRT显示屏和打印绘图机。

分光光度法在生化实验中的应用

分光光度计用于常规吸光度测定和吸收光谱扫描，常用方法包括导数分光光度法、催化动力学分光光度法和差示分光光度法。在生化实验中，主要用于氨基酸含量测定、蛋白质含量测定、核酸测定、酶活力测定、生物大分子鉴定和酶催化反应动力学研究等。