凝胶层析（又称分子筛层析）是生物分子下游纯化中最基础、最通用的技术之一。其原理是利用多孔凝胶介质按分子大小分离混合物：大分子无法进入凝胶孔内，先被洗脱；小分子进入孔内，路径更长，后被洗脱。选择合适的凝胶介质需综合考虑目标分子的分子量范围、分辨率要求、流速和载量等因素。本文系统梳理了针对不同生物分子（蛋白、核酸、多糖、疫苗等）的凝胶选择策略，并结合最新技术进展提供实用指南。

1. 测定目标分子特性
在纯化前，需测定目标蛋白的分子量、等电点（pI）等物理化学性质。若未知，可用PAGE电泳或分析型凝胶过滤（如Superose HR预装柱）测定分子量。pI可通过少量离子交换介质在不同pH缓冲液中快速测定，以确定纯化缓冲液的最佳pH。

2. 凝胶过滤介质的选择原则
根据目标分子量选择分离范围合适的介质：

• Superose系列（如Superose 6 Increase、Superose 12）：适用于宽分子量范围（5×10³~5×10⁶ Da），分辨率高，适合未知蛋白的初步分离。
• Sephacryl HR系列（如Sephacryl S-100 HR、S-200 HR、S-300 HR、S-400 HR、S-500 HR）：适用于中等至高分子量（1×10⁴~1×10⁷ Da），流速快，适合中试和工业生产。
• Sephadex系列（如G-25、G-50、G-75、G-100、G-200）：适用于小分子脱盐、缓冲液置换及小分子量蛋白分离（<1×10⁵ Da）。其中G-25最常用于蛋白质脱盐。
• Superdex系列（如Superdex 75、Superdex 200、Superdex Peptide）：结合了Sephadex的高分辨率和Sepharose的机械强度，适合精细纯化，尤其适用于肽类（Superdex Peptide）和中等分子量蛋白。
• Sepharose系列（如Sepharose 4 Fast Flow、6 Fast Flow、CL-4B、CL-6B）：适用于大分子复合物、病毒、质粒DNA等（>1×10⁶ Da），流速快，可放大。

3. 针对不同目标分子的具体选择

3.1 蛋白质与酶
对于未知蛋白，首选Superose 6或12进行分子量测定和初步分离。若需高分辨率精细纯化，使用Superdex 75（分子量3×10³~7×10⁴ Da）或Superdex 200（分子量1×10⁴~6×10⁵ Da）。对于大量粗提，可使用Sephacryl S-200或S-300 HR以提高流速。

3.2 单克隆抗体（IgG）
IgG分子量约150 kDa，常用Superdex 200进行精细纯化，去除聚集体和宿主蛋白。也可用Sephacryl S-300 HR。对于IgM（约900 kDa），推荐Superose 6或Sepharose 4 Fast Flow。

3.3 重组蛋白与融合蛋白
重组蛋白常带His标签或GST标签。在变性条件下（如8 M尿素）纯化包涵体蛋白时，需使用高化学稳定性的介质，如Superose 12或Sepharose 6 Fast Flow。复性后可用Superdex 75或200进行精细纯化。

3.4 肽类
肽类分子量小（<10 kDa），推荐Superdex Peptide HR（分离范围100~7000 Da）或Sephadex G-25/G-50。反相层析（如SOURCE 15RPC）常与凝胶过滤联用。

3.5 核酸与病毒
质粒DNA（>2 kb）和病毒颗粒（如腺病毒、慢病毒）分子量大，需使用Sepharose 4 Fast Flow或6 Fast Flow，或Sephacryl S-500 HR。对于寡核苷酸（<100 nt），可用Sephadex G-25脱盐或Superdex Peptide。

3.6 多糖与中草药有效成分
多糖分子量分布广，常用Sephadex G系列（如G-75、G-100）或Sephacryl S系列。Sephadex LH-20兼具吸附和分子筛功能，适合分离黄酮、皂苷等天然产物。

3.7 疫苗
疫苗颗粒（如乙肝疫苗、狂犬疫苗）分子量大，常用Sepharose 4 Fast Flow。柱高40~70 cm，处理量可达床体积10%以上。小分子疫苗（如甲肝疫苗）可用Sephacryl S-500 HR。

4. 脱盐与缓冲液置换
脱盐是凝胶过滤最常见的应用之一。Sephadex G-25是最经典的脱盐介质，处理量可达床体积30%，柱高10 cm即可。HiTrap Desalting（5 ml）和HiPrep Desalting（26 ml）预装柱方便快速操作。

5. 去除污染物
凝胶过滤可有效去除内毒素、核酸、病毒等污染物。例如，内毒素聚集体可通过凝胶过滤去除；核酸酶切后的小片段可用Superdex去除。结合离子交换或疏水层析可进一步提高纯度。

6. 最新技术进展
近年来，Superose 6 Increase和Superdex 200 Increase等新一代介质提供了更高的分辨率和流速，适合高精度分析。此外，扩张柱床吸附（EBA）技术如STREAMLINE系列，可直接从发酵液中捕获目标蛋白，将离心、超滤和初纯化结合，提高回收率并缩短周期。

总结：选择凝胶介质需根据目标分子的分子量、纯度要求、样品体积和工艺规模。对于未知样品，建议从宽分离范围的Superose或Sephacryl开始，再根据结果优化。精细纯化推荐Superdex系列，脱盐首选Sephadex G-25。结合多种层析技术（离子交换、疏水、亲和）可达到最佳纯化效果。