关于应用荧光原位杂交技术进行产前诊断的可行性探讨的问题
时间:2010-09-21 21:30来源: 作者: 点击:
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作者:许争峰 王迅美 潘淑娟 张锡然 陈宜峰 单位:许争峰(南京市鼓楼医院 210008);王迅美(南京市鼓楼医院 210008);潘淑娟(南京师范大学生物系);张锡然(南京师范大学生物系);陈宜峰(南京师范大学生物系) 关键词:荧光原位杂交 产前诊断 染色体异常 江苏医药001110 【摘要】 目的 探讨荧光原位杂交技术(FISH)应用于绒毛及羊水间期细胞进行产前诊断的可行性。方法 应用18、X号染色体着丝粒探针及21号染色体特定区域探针,分别对绒毛及羊水间期细胞进行荧光原位杂交,并与中期分裂相进行比较分析。结果 绒毛及羊水间期细胞均出现了杂交信号,尤以绒毛细胞杂交比率高,信号强;常染色体探针出现3个及1个杂交点的比率约为1%和6%,X染色体探针出现3点的比例也在1%左右。结论 荧光原位杂交技术对检出染色体非整倍体有较强的特异性,同时也为染色体非整倍体的检出提供了诊断依据。FISH技术应用于产前诊断具有快速、简便、灵敏的优点,有较大的临床应用价值。 A study on the feasibility of prenatal diagnosis by using interphase fluorescence in situ hybridization XU Zhengfeng,WANG Xunmei,PAN Shujuan,et al. (Nanjing Gulou Hospital,210008) 【Abstract】 Objective To evaluate the possibility of fluorescence in situ hybridization (FISH) in prenatal diagnosis.Methods It was preformed on uncultured amniocytes and chorionic villus cells by using 18 and X α-satellite probes and 21-specific repeated sequences probe.Results Two types of cells can produce hybridization signals.It gives the most specific singnal for mesenchymal chorionic villi.The results of autosome probes showed about 1% trisignals and 6% monosignals in normal chorionic villi and amniocyte cells.The results of X chromosome also showed a very low trisignal rate(about 1%)in normal fetals.Conclusion These can provide references for diagnosis of monosomy and trisomy of autosomes and trisomy or multisomy of X chromosome.Compared with traditional cell genetic method,interphase FISH,is easy and rapid,so it useful in clinical diagnosis. 【Key words】 Interphase FISH Prenatal diagnosis Chromosome abnormal. 染色体异常的产前诊断传统采用绒毛及羊水细胞进行培养,然后进行细胞遗传学分析,这一过程费时费力,培养周期长,并易感染而导致培养失败。1986年,Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交(FISH)技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性[1,2],从而开辟了间期细胞遗传学研究的新领域。国外已有实验室将这一技术应用于遗传病的产前诊断上[3]。我们选用18、X染色体着丝粒探针及21号染色体特定域探针,分别对绒毛及羊水间期细胞进行了原位杂交,并结合中期核染色体分析,以探讨FISH技术在产前诊断中应用的可行性。 材料与方法 一、标本制备 1.绒毛标本制备 取人工流产孕龄为39~80天的绒毛组织约50 mg,共71例。解剖镜下仔细剔除蜕膜及其它污染物,置于胶原酶溶液(终浓度250 IU/ml)中消化15 min,加入适量生理盐水洗涤,离心,0.075M氯化钾低渗(加入秋水仙素,终浓度0.1 μg/ml)40 min,甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定,气干,部分标本镜检后划定杂交区域,37℃老化过夜,部分标本作染色体分析。 2.羊水标本制备 进行产前诊断的孕龄为16~22周孕妇57例,在B超引导下行羊膜腔穿刺,取羊水35 ml,10 ml经1 000 rpm离心10 min,0.075M氯化钾低渗30 min,固定,气干,镜检划定杂交区域,37℃老化过夜。剩余25 ml进行培养,约10天后按常规方法收获细胞进行染色体分析。 二、原位杂交 1.探针 地高辛标记的18、X染色体着丝探针(D18Z1、DXZ1)购于美国Oncor公司(下文简称18号、X号探针),生物素标记的21号染色体特定区域探针(881D2)为我们从实验室YAC库中制备(下文简称21号探针)。 2.荧光原位杂交、洗脱、免疫放大均按实验室常规进行[4]。 3.镜检OLYMPUS BH-2X型荧光显微镜观察。分别计数0个、1个、2个、3个及多个杂交点的细胞。每个绒毛样品至少计数500个细胞,羊水样品至少计数100个细胞,信号重叠者不计数。染色体异常则按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)》描述。 结 果 一、染色体核型分析 71例绒毛染色体核型中,成功分析68例,其中33例为46,XX,34例为46,XY,1例为46,XX,rob(13;21)。57例羊水均成功进行中期染色体核型分析,其中29例为46,XX ,28例为46,XY。 二、间期核FISH分析 (1)绒毛细胞:18、21、X探针杂交后,杂交信号均强,易计数,只有极少数信号不规则,经统计杂交率在99%以上。18及21号探针杂交后,细胞中大多数呈现2个杂交点(90.2%~97.8%),少数显示3个(0.2%~2.3%)及1个(0.8%~6.2%)(其中有3例出现1个点的比率为19.8%,21.4%,22.4%则不计在内)。X号探针杂交后,按1点及2点的相对比例将标本进行性别分类,男性胎儿中出现1点的比率为96.5%,女性胎儿中出现2点的比率为94.4%,3点及多点出现率为1%左右(0~3.3%)(有2例标本出现3点的比率为11%、12%则不计入上述统计资料),与染色体分析结果一致。(2)羊水细胞:在未用蛋白酶K进行处理的标本中,羊水细胞的杂交率仅为15%~25%,后改用蛋白酶K处理标本,杂交率上升到51%。18及21号探针杂交后,出现2点的比率为88.6%(82.8%~96.0%),3点的比率为2.3%(0~4.9%),1点比率6.9%(2.9%~12%),偶有多点。X号探针杂交后,与染色体核型对比,发现男性胎儿出现1点的比率为93.7%(89.1%~97.8%),女性胎儿2点率为90.6%(85.1%~96.8%),3点及多点率为1%(0~3.3%)(详见表1,2)。 表1 18及21号探针杂交例数、细胞数及结果中各信号点的比例(%) 标本 D18Z1 881D2 绒 毛 羊 水 绒 毛 羊 水 例数 68 57 68 54 细胞数 38000 6500 38000 6000 1点 4.9 (1.0~6.2) 8.3 (3.4~12) 2.9 (0.8~5.9) 5.8 (2.9~8.8) 2点 94.1 (91.0~97.8) 88.6 (82.8~93.2) 94.9 (90.2~96.7) 92.1 (88.7~96.0) 3点 0.8 (0.2~1.6) 2.3 (0~4.9) 0.9 (0.4~2.3) 1.6 (1.0~2.5) ≥4点 0.4 (0~4.1) 0.8 (0~3.1) 1.3 (0.6~3.0) 0.6 (0~2.2) ?此表不包括3例出现1点比例明显高于一般标本者 表2 X探针杂交例数、细胞数及各种信号点的比例(%) 标本 男性 女性 绒 毛 羊 水 绒 毛 羊 水 例数 26 25 25 27 细胞数 15000 2600 15000 2800 1点 96.5 (94.0~98.2) 93.7 (89.1~97.8) 4.1 (2.2~7.9) 6.8 (0~10.5) 2点 3.1 (1.9~4.1) 6.0 (2.2~10.4) 94.4 (91.1~96.0) 90.6 (85.1~96.8) 3点 0.4 (0-2.0) 0.2 (0-0.3) 0.9 (0.2-2.4) 1.8 (0.8-3.3) ≥4点 0.1 (0~0.2) 0.1 (0~0.2) 0.6 (0~1.6) 0.8 (0~2) ?此表不包括2例3点比率明显高于一般标本者讨 论 经典的细胞遗传学研究材料仅限于中期细胞的染色体,FISH技术则还可用于间期细胞,而获得间期细胞比获得中期分裂相容易得多。本实验的主要目的就是探讨FISH技术利用绒毛及羊水间期细胞进行产前诊断的可行性。 实验显示,绒毛组织是理想的利用FISH技术进行产前诊断的材料。选择18、21、X号探针进行杂交均取得了理想的杂交效果。杂交率接近100%,杂交信号强,分布集中,能迅速准确计数。结果还显示,二倍体细胞中出现1点及3点的比率均不超过6%,因此,用FISH技术诊断染色体非整倍体有较强的特异性。值得一提的是,实验中出现了5例杂交结果与其它标本有明显区别的标本:18号探针与R6、R13、R52标本杂交时,出现1点的比率明显高于其它标本;X探针在与R41、R57标本杂交时,出现3点的比率明显高于其它标本。按Klinger制定的诊断非整倍体的标准[5],本组5例标本尚不能诊断为非整倍体,但我们认为,这5例标本出现1点或者3点的比率明显高于其它标本,不能排除存在嵌合体的可能。可惜因获得的绒毛标本中期相偏少,不足以证实嵌合体的存在。依据我们的资料认为,在用绒毛进行FISH产前诊断时,如遇到1点及3点比率超过10%时应考虑有单体或三体嵌合性的可能,须作羊水细胞培养。 间期羊水细胞杂交率较低,这与羊水细胞中大部分为胎儿脱落的角化鳞状上皮细胞,核内染色质已发生固缩,或羊水细胞被一层较厚的细胞质覆盖,探针难以进入细胞有关[5]。我们应用蛋白酶K处理标本后进行杂交,使杂交率上升到51%。羊水细胞杂交率与标本的新鲜程度也有关,取材处理后直接杂交,效果明显优于保存数天后的标本。 实验结果显示,应用FISH技术,能快速检出胎儿的染色体非整倍体,并可省略细胞培养的繁琐过程,对产前诊断胎儿染色体畸变,有重大的临床意义。 本课题受江苏省计划生育委员会基金资助(BS95019) 参考文献 1,Cremer T,Lanegent J,Bruckner A,et al.Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and nonradioactive in situ hybridization techniques:Diagnosis of trisome 18 with probe Ll.84.Hum Genet,1986,74:346-352. 2,Licher P,Cremer T,Tang JC,et al.Rapid detection of human chromosome 21 aberraion by in situ hybridization.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:9664-9668. 3,Norio Miharu,Robert G.Best,S.Robert Young.Nunerical chromosome abnormalities in spermatozoa of fertile and infertile mem detected by fluorescence in situ hybridization.Hum Genet,1994,93:502-506. 4,薛妹朗,陈宜峰,张锡然,等.用生物素探针原位杂交法快速测定中期和间期细胞染色体数目畸变.中华医学遗传学杂志,1993,10:352-354. 5,Klinger K,Langes G,Shook D,et al.Rapid detection of chromosome aneuplodies in uncultured amnicocytes by using fluorescence in situ hybridization (FISH).Am J Hum Genet,1992,51:55-65. (收稿:1999-10-21 修回:1999-12-08)(文章出处:江苏医药 2000年第11期第26卷)
(责任编辑:glia) |
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