自1978年Bert Sakmann和Erwin Neher将膜片钳技术(patch-clamping techniques)引入实验室以来,该技术已广泛应用于细胞电生理研究,并因此获得1991年诺贝尔奖。膜片钳技术被誉为研究离子通道的“金标准”,能够验证细胞膜上离子通道的存在,并深入研究其电生理特性、分子结构及药物作用机制。
膜片钳技术并非普及度高的实验技术,它需要特殊仪器,如膜片钳实验系统和微电极放大器,同时操作人员需具备一定的电学基础。来自英国赫特福德郡大学细胞与膜生理学的专家Areles Molleman在其著作《膜片钳:电生理学入门指南》中总结了膜片钳技术的十个关键优化步骤:
1. 动作轻柔
在将微管放置到持有器上时,需小心避免与放大器的电极产生强烈接触,以免引起噪音和损坏放大器。可以通过接触地面或在放置微管前连接金属丝到地面电位来减少噪音。
2. 利用少许压力
在接触细胞之前,需在微管溶液中施加4-6英寸的水压,以确保bath中无杂质,同时吸液管溶液需保持洁净。
3. 不用在意吸液管被打碎
在定位吸液管时,初期可能会打破几个吸液管,这是正常现象。应分析每次失败的原因,以便快速改进。
4. SUPERFUSION是开还是不开?
开启superfusion可能导致化学物质浪费和吸液管污染,但如果细胞未能良好贴附,开启superfusion有助于调整细胞并打破密封。
5. 吸液管大小
孔径较大的吸液管有助于记录整个细胞,因为suction pulses更易穿过细胞膜。吸液管的大小应根据获得seals的成功率来决定,通常选择电阻约为2MΩ的较大吸液管。
6. 选择正确的角度
吸液管与细胞接触的角度应为45度至60度,尽量选择细胞上与吸液管轴垂直的部分,以获得良好的密封。
7. 吸出
在接近细胞时,电阻的变化可指示何时关闭超压。一般而言,电阻下降约10%时应关闭suction,但不同细胞类型的情况可能有所不同。
8. 承认错误
如果监控的电阻大幅降低,应放弃当前操作,使用新的吸液管重新开始,以节省时间。
9. 鉴别和去除漂移
在使用显微操作器时,需确保设备调节到减少振动,以避免漂移影响操作。
10. 当钳出来......
完成密封后,可施加holding potential。注意,取出吸液管后细胞将无法再从放大器获得电流,因此应谨慎操作。