自1978年Bert Sakmann和Erwin Neher将膜片钳技术(patch-clamping techniques)带入了我们的实验室——他们也因此获得了1991年的诺贝尔奖,这种技术就得到了越来越广泛的应用。作为先进的细胞电生理技术,膜片钳已成为了研究离子通道的“金标准”:这种技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。 应该说膜片钳技术不是一个普及度高的实验技术,它需要一些特殊仪器,比如膜片钳实验系统,微电极放大器,也需要操作人员补充一些电学方面的基本理论。来自英国赫特福德郡大学细胞与膜生理学的Areles Molleman,一位膜片钳方面的专家告诉我们,膜片钳技术的关键在于在细胞膜和微管(micropipette)之间获得一个seal(密封),以下是他在Patch Clamping: An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology中提到的膜片钳技术的关键点: 1.动作轻柔 当将微管(micropipette)放置到holder上的时候,你可以很容易的在你和放大器(amplifier)“热”电极之间产生电接触。如果不与地面电位(electrical ground)连接的话,那么就像是一个巨大的触角,会引起很大的噪音。这会造成一些放大器的损伤,尤其是如果你聚集了一些静电噪声的时候。利用空余的那只手接触地面,或者在放置微管之前连接金属丝到地面电位,后者可以在你作为法拉笼(Faraday cage,又称静电屏蔽笼,用以防止杂电场对膜片钳放大器的探头电路的干扰)一部分的时候减少噪音。 2.利用少许压力 在靠近液体表面和接触细胞之前要在微管溶液中施以4-6英寸的水压,这可以通过膜片管holders另外的线路,用嘴更好——一个简单的U试管。这种电压能可以让bath中不留任何碎片,当然吸液管溶液也必须十分干净。 3.不用在意吸液管被打碎 每一步由于对操纵器和光学方面的感觉不同都会有所差别,在将吸液管定位在细胞附近的时候,刚开始总是会打破几个吸液管的,这是十分正常的。不要因此而沮丧,要分型一下每次做错的原因,这样能获得很快的进步,而且在到下一步的时候依然要重复这个过程。 4.SUPERFUSION是开还是不开? 打开Superfusion会导致一些化学物品的浪费,也许是昂贵的药物,而且会增加吸液管污染的可能性,但是,如果你的细胞并没有很好的贴在底物上,造成紧密的seal(没有superfusion),那么打开superfusion,能很容易的调整细胞,打破密封。另一持续打开superfusion的原因是微环境调控,除非你能很确定稳定和pH值不会大幅度的变化,那么还是让superfusion开着吧。 5.吸液管大小 一个孔径尺寸大的吸液管有利于整个细胞的记录,这主要是因为用suction pulses容易穿过细胞膜,因此在记录的过程中不用重新再来,细胞质中吸液管溶液也可以很快得以交换。因此在整个细胞记录过程中吸液管的大小是由获得seals的成功率决定的,可以尽可能的考虑大尺寸的吸液管,电阻大约是2MΩ。另外小孔径的吸液管适合于单孔道记录。 6.选择正确的角度 要进行一次好的密封就需要一次优良的接触,吸液管接触细胞的角度通常是45度到60度,在放置吸液管的时候,试着选择细胞上与吸液管轴垂直的部分。这不难,但是在平展的细胞上可能有些难得,有时可以利用由细胞核造成的凸出来完成。而纺锤形状的细胞则可以以90度来靠近其轴心。 7.吸出 什么时候就能关掉超压(over-pressure),完成一个seal呢?在靠近一个摆动检测脉冲(毫伏)的过程中就说明吸液管“看到”了电阻(电流反应越大电阻越低),接近细胞会增加电阻,降低电流反应。在许多例子中,大约10%的下降就说明要关掉suction,但是不同的细胞类型有不同的情况,而且超压应用的情况也有影响。也就是说,一旦一种细胞类型建立了可靠稳定的规则,那么就把它记录下来。从压力到吸出的转换(通常是由口来完成)应该是快速和顺畅的,如果你离开吸液管一会(没有压力或者sucion),那细胞膜就会摇摆,污染吸液管口,无法完成良好的seal。 8.承认错误 如果发现你监控的电阻大幅度降低,那么放弃这一次。你的tip将会被污染,就像上面说的那样,无法得到好的密封,承认错误,用一只新的吸液管重新开始是最节约时间的方法。 9.鉴别和去除漂移 有没有在利用显微操作器(micromanipulator)这种低漂移特征的仪器操作时,发现微吸管在显微镜下滑动?在对显微操作器抱怨之前,你需要确保你的操作器已调节减少振动了。漂移有可能是由于操作器装载过重,或者电缆和与headstage接触的试管扭转力过大,请尽量避免这些情况的出现。 10.当钳出来......
在完成一个密封(seal)之后,可以加以holding potential。通常你所认为的是一个来自细胞的休眠细胞膜电压,在吸液管下的膜片将会被去极化,但是一旦你取出,细胞将不再能从放大器里获得强大的电流jolt。这种钳出可以通过吸出脉冲(suction pulse)或者电流脉冲(current pulse)完成。吸出对于尺寸大一些的吸液管(<3MΩ)比较合适,而另一个则适合于小吸液管(>6MΩ),中间的范围需要反复试验,但是一旦你对你的细胞有了一套方法,那么就坚持下去,有时一些污染会骗了你。用小量持续的suction,而电流脉冲则可以不断的增加,如果你看到许多噪音出现,回到原来的suction脉冲。 (责任编辑:泉水) |