将反应物和Marker点样于凝胶一起电泳，紫外光下观察结果，拍照保存结果。反应物也可用于印迹（杂交）实验、多态分析、探针制备等。

　　注意事项：①DNA样品纯度高，Taq酶（和Klenow酶）有逆转录酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②设计的引物分子内（特别3′端）和引物，1，2分子间不形成双链。选择性好，不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G＋C含量为40％-60％。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误，一般在200μmol/L，有人建议40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L对酶有抑制作用。Mg²⁺浓度过高，NDA不易变性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶从嗜热菌分离得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐热每经过一次热变性要补加一次酶），现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH8.3～8.8（室温8.3-8.4），反应温度75-80℃，95℃以上失活明显。无3′→5′校读活性，对SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐温－20可抵制SDS抑制）。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm－5℃，但实际上与引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性退火，而造成非特异扩增，此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多，增加次数可提高灵敏度，但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高，被检样品极易被污染，样品纯化，扩增，检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃，处理。

　　三、核酸限制性片段长度多态性（RFLP）分析

　　RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹（blot）技术、探针-杂交技术的综合应用，多用于临床遗传性疾病的基因诊断。基本原理是遗传性疾病多有基因的缺陷，如基因缺失、基因插入、编码区小范围核苷酸序列改变或点突变等。前二者可将纯化的正常人和病人DNA同时用限制性内切酶切成片段，经电泳分离、印迹、探针杂交等找到目的基因。由于患者基因的缺失或插入，造成被限制性内切酶切开的片段（分子量）大小与正常人发生差异（限制性片段长度多态），使其电泳迁移率发生差异，而达到基因诊断的目的。小区域或点突变，可选用一个限制性内切酶的切点正好在这一变异位置，使切割作用和正常人发生差异（如正常人基因可切断而患者不能，或反之），达到诊断目的。现在PCR产物经变性为DNA单链，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，只要有一个核苷酸发生变异，其电泳迁移率就会改变，进行多态分析（PCR-SSCP）。实际上把基因的异常位置设计在PCR扩增区域内，就能进行多态分析。（图18-8）

　　核酸纯化→内切酶作用→电泳分离→Southern blot→探针-杂交→显影，显色

图18-8　点突变Eco R1 RFL

　　四、核酸一级结构（核苷酸序列sequence）分析

　　核酸一级结构分析是基因分析最直接的第一手资料。目前DNA、RNA以及蛋白质的一级结构分析中，DNA的碱基序列分析方法多样、简单、快速。下面就M13噬菌体-双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA测序法介绍如下。

　　M13是单链DNA噬菌体，转染宿主菌体复制为双链增殖，又以单链形式透出菌体。把待测DNA重组插入双链M13复制型DNA中，经培养扩增，可分离得到单链M13DNA（含待测单链DNA的碱基序列），即复制模板。在待测DNA的3′端人工合成引物，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，复制链延长。在ddNTP（2′,3′双脱氧核糖核苷三磷酸）存在下，复制延长随机受阻，形成分子量（长度）大小不等的片段。电泳分离，自显影，读图18-9分析碱基序列。

图18-9　核酸碱基序列分析

　　0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝胶，高压（1600V）电泳，可分辨一个核苷酸的差异。电泳后干燥凝胶，自显影，自下往上读图，得到5′→3′的合成链碱基序列，其互补链是待测DNA的3′→5′碱基序列。