一质粒制备
1质粒的转化和扩增
1.1制备XL1-Blue感受态细菌
1．取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol／LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml（含15％甘油）冰冷的CaCl2重悬细菌，分装（200μ／tube），-80℃保存。
2．转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng／μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3．轻轻摇匀，冰浴30min。
4．42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5．加入LB培养液（无氨苄青霉素）0.8ml，在37℃，100转／min水浴孵育60min。
6．取200μl菌液铺于琼脂板上（涂有X-Gal（20mg／ml）-IPTG（200mg／ml）的LB-氨苄青霉素50mg／ml,1μl／ml培养基），待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落
1．用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转／分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol／LEDTA（pH8.0）。
2．加入50μl新配置的0.2mol／LNaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振荡30秒。
3．在70℃温育5min，然后冷却到室温。
4．加1.5μ14mol／LKCl和0.5μ1含0.4％溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5．12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。
6．制备1％的琼脂糖凝胶（含EB0.5μg／ml），取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。
7．当溴酚兰迁移到凝胶全长的2／3-3／4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化
1．用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素（50μg／ml）培养液的聚丙烯管中，于37℃，200转／分培养3h。
2．将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37℃，200转／分培养过夜（12-16h），细菌浑浊。
3.菌液中加入氯霉素液（34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170μ／ml）。37℃，200转／分培养12-16h。
4.将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4℃离,th,15min，沉淀细菌。
5.弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5min
6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10min。
7.加入预冷的溶液III3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10min，出现白色絮状沉淀。
8．6000rpm，4℃离心15min，保留上清。
9．将上清（若带细菌残片，则再次离心）移入另一50ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10min。（或-20℃4h，或4℃过夜，可便核酸沉淀）
10.12000rpm，4℃离心15min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。
11．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12．用500μlTE（pH8.0）溶解核酸沉淀，转移至1.5mlEppendorf管中。
13．加入用冰预冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混匀。12000rpm，4℃离心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000rpm,4℃离心15min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶（20μg/ml）的TE缓冲液（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转移到另－1.5mlEppendorf管中，室温放置1.5mlEppendorf管中30min。
18．加入400μl13％（v／v）的PEG8000-NaCl（1.6mol／L），混匀，4℃12000rpm离心5min以回收质粒DNA，弃去上清。
19．加入400μlTE缓冲液（pH8.O）溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、和氯仿各抽提一次。
20．将水相（上清）移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1体积（约50μ13M的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积（大约1ml）的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30min。
21．于4℃12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22．加入400μl处于4℃的70％乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4℃12000rpm离心2min。
23．吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24．用100μlTE缓冲液（pH8.0）溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度（OD260／OD280>1.8。OD260／OD280对DNA而言其值大约为
1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。；DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数（μg／μl）。
26．质粒DNA溶液于-20℃保存待用。
二、cRNA探针的标记
1．将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2．线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
3．进行体外转录，步骤如下：
4．在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。DEPC处理的三蒸水8μl
质粒DNA模板0.05μg／μl 1μl
10xNTP地高辛标记混合物 1x 2μl
0.1MDTT溶液 10mM 2μl
5x转录缓冲液1x 4μl
RNAse抑制剂 2U／μl1μl
RNA聚合酶 2U/μl 2μl
反应体系总体积 20μl
5．加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37℃孵育2h。
6．加入2μl无RNA酶的DNA酶I（10U／μ1），37℃孵育15min降解模板DNA。
7．加入0.2MEDTA（pH8.0）溶液2μl终止反应。
8．加入2.5μl的4MLicl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置2h。
9．12000g下离以15min，弃上清，小心地用50μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。
10．室温下稍干燥，溶于100μ1DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20℃下保持备用。
三、原位杂交
3.1冰冻切片与杂交前预处理
1．将子宫样品从-80℃取出，用OCT包埋，在-23℃（切片机腔体温度）平衡至少30min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸（1mg／m1）的玻片上（玻片预先经180℃干烤6小时），保存于-70℃冰柜备用。
2．冰冻切片经室温干燥10min后，在4％的多聚甲醛-PBS（pH7.4）固定l0min。
3．活跃的DEPC-PBS（未高压的0.1％DEPC-1XPBS溶液）洗2次，每次5min。
4．在0.2M的盐酸作用中作用10min后，重复步骤4）。
5．在切片上滴加蛋白酶K（0.1μg／m1），37℃孵育15min，重复步骤4）。
6．经0.1MTEA（三乙醇胺）作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1MTEA（乙酸酐／三乙醇胺，pH8.0）中乙酰化10min。（在大多数实验中，步骤4，5，6省略）
7．5xSSC中平衡15min。
3.2杂交
8．在脱水后的玻片上滴加预杂交液（约100μl／玻片），置于放有湿盒液（50％甲酰胺v／v；0.3MNaCl；1MmEDTA；10mMTris-Cl，pH8.O）的湿盒中，55～58℃下的烘箱中预杂交2h。
9．甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针（浓度1-2ng／μl）经70℃变性1O分钟，置冰上1min，玻片上滴加预杂交液（约60μl／玻片），覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58℃下杂交18-30h。
3.3杂交后处理
10．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52℃预热的5×SSC洗30min。
11．在无DNA的RNA酶A（20μg／ml）溶液中37℃下孵育30min。
12．分别依次用52℃预热的2XSSC，1XSSC和O.1XSSC洗2次，每次30min。
3.4杂交信号检测
13．在缓冲液A（0.1MTris-HC1pH7.5，0.15MNaC1）中平衡5min。
14．在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（1：500～1:2000稀释于含0.5％阻断液的缓冲液A中），室温反应2h。
15．用缓冲液A洗2次，每次15min。
16．在缓冲液B（0.1MTris-HCl；0.1MNaCl；0.05MMgCl_2，pH9.5）中平衡5min。
17．硝基四氮唑蓝（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐（BCIP）溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1NBT和3.5μ1BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18．充分显色后，用EDTA（1mMEDTA，pH8.0）洗15min终止反应。
19．在95％乙醇中洗lh以除去非特异的背景。
20．用蒸馏水洗15min除去可能存在的结晶体。
21．脱水、透明，用中性树胶封片。
22．充分干燥后在显微镜下观察、照相。