普通FISH原位杂交技术最早是于1969年由Gall和Pardue建立,它可将被标记的DNA或RNA探针定位到特异的细胞或染色体部位。传统的放射自显影原位杂交技术在时间及精确定位等方面均有其固有的局限性,为此,许多非放射性标记方法先后被提出,其中较常用的就是荧光原位杂交技术。它用生物素标记探针,通过荧光-抗生物素蛋白酶联反应在细胞水平进行检测,显微镜下观察到的荧光信号即表示探针杂交的部位。染色体FISH是以非同位素将具有染色体区域特异性的核甘酸序列标记成探针,与靶细胞中期染色体进行原位杂交,即探针同染色体上相应的互补序列形成碱基配对,然后再用带荧光的抗体进行抗原-抗体反应的放大和检测,使杂交的染色体区域显示荧光信号。FISH技术不仅可以测定中期染色体的特异序列,而且也能敏感地测定间期细胞核中的特异序列,这一优势在白血病的检测中尤为重要,因为它弥补了白血病患者骨髓细胞培养后难以获得高质量中期染色体的缺陷。DNA纤维荧光原位杂交应用普通FISH,中期染色体的克隆排序需要不同标记的克隆相距1Mb以上,因此中期FISH的分辨率远远不能满足更精细的物理图谱的定位需要。DNA纤维荧光原位杂交应用各种不同技术,将待研究细胞的全部遗传物质即DNA在载玻片上制备出DNA纤维,而所研究区域的DNA片段则可用不同颜色荧光物质标记为探针,分别杂交到DNA纤维上,因而可在荧光显微镜下直接观察结果。该方法现已应用于克隆排序、人类基因组高分辨物理图的绘制、染色体结构分析和致病基因的定位克隆等多个方面。DNA纤维制备主要有两种方法,即细胞裂解法和非裂解法。细胞裂解法是用碱、高盐、SDS、甲醛等化学试剂处理细胞,使间期核染色质结构松散,从核骨架中释放出来,形成高度伸展的染色质纤维。非裂解法包括低熔点琼脂糖包埋法和分子梳法等。其中低熔点琼脂糖法是将包埋在琼脂糖中的细胞用蛋白酶K消化,生成高分子量的DNA,在玻片上机械拉伸DNA纤维。分子梳法是将克隆分离得到的DNA一端固定到硅化载玻片上,用另一未经处理的玻片封住DNA溶液,溶液蒸发后使DNA分子变直、伸展。DNA纤维荧光原位杂交技术的步骤与普通FISH基本相同。与其他染色体FISH技术相比,DNA纤维FISH的优点是分辨率高,可达到1~500kb,可快速对探针排序、确定方向、测定探针间距离;较适用于端粒附近基因富集区的基因排序;对材料要求不高,新鲜组织,冰冻组织或石蜡标本等均可;对基因拷贝数的判定比较准确,可消除传统的中期FISH由于信号分裂引起基因拷贝数判断错误。比较基因组杂交染色体异常可见于多种恶性肿瘤细胞,如多种白血病、淋巴瘤及实体瘤中可见反复出现的高度一致的染色体数目和结构异常。识别这些染色体异常和分子标志变异对于上述肿瘤的诊断和预后具有重要的临床价值。FISH技术提供了检测染色体异常的有力手段。但是FISH依赖于和已知探针进行杂交,不宜于发现新的染色体异常。且在一次实验中只能用一个探针来筛选整个基因组,要发现基因组中的所有异常就要做大量的工作。CGH方法是近年来在多色染色体FISH基础上发展起来的种新的分子遗传学技术,可用来确定间期核或中期细胞的染色体异常,且不需进行肿瘤细胞培养和制备其中期染色体标本,也不需事先了解染色体的结构和可能存在的异常。在一次实验中就可对整个基因组中所有的染色体异常进行总的分析。该技术在血液系统恶性肿瘤研究中已得到广泛应用。CGH的基本原理与FISH技术相似。一般常采用生物素-卵白素和地高辛-抗地高辛两种标记体系。用生物素脱氧核苷酸标记待检DNA,用地高辛脱氧核苷酸标记正常对照DNA,然后将两种探针同时与正常人中期染色体标本进行抑制性原位杂交,杂交后将待检DNA用荧光素异硫氰酸盐-卵白素检测,对照组DNA采用罗丹明-抗地高辛检测。由于肿瘤DNA和对照DNA在染色体位点上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少,因此可根据红、绿两种荧光强度的比值进行定量。肿瘤DNA中的基因扩增或染色体重复表现为绿、红两种荧光强度比值增高,而染色体的缺失或丢失表现为此比值降低。多重FISH普通FISH的限制之一是其不能鉴别一个以上的靶序列,MFISH的引进使得检测一个以上的靶序列成为可能。1990年,Nederlof等介绍了一种方法,即综合标记或者称按比例标记。采用一种以上的半抗原以不同比例标记探针,并用一种以上的荧光来进行检测。如采用3种荧光染料按比例标记,结合数字成像显微镜,可于中期细胞中检测到7种DNA探针。理论上,应用n种荧光分子的组合数是2nl,即4种不同的荧光分子可检测15种靶序列,5种检测31种DNA序列,以此类推。因此,人们推测用染色体涂染探针来鉴别人24条不同的染色体时需要5种不同的荧光染料,即赋予22条常染色体和2条性染色体以24种不同的颜色。经过几年的不断探索,1996年Speicher等成功地建立了M-FISH。 MFISH可以检测许多具有结构异常标本或肿瘤样本中简单或复杂的染色体异常。在某些病例中,MFISH可以解决常规染色体分析不能精确识别的染色体异常。如MFISH可识别染色体数目异常及一些结构重排,如整条染色体的获得或丢失、简单或复杂的易位。应用比例长度分析及染色体条带转换图也可以识别染色体易位断裂点。M-FISH可以从已定论的疾病如白血病中发现新的隐匿的染色体异常。M-FISH也有一定的局限性,在进行核型分析时涂染探针不能检测染色体臂内或臂间倒位,不能检测涉及同一染色体臂的插入及临床相关的一些微缺失综合征中出现的小的重复或缺失等。 实验室检验网 (责任编辑:glia) |