PCR-ELISA端粒酶检测法

端粒是真核生物染色体末端的特异DNA-蛋白结构，端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列，这一序列在生物进化中有高度的保守性（人重复序列为TTAGGG）。已确认端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合（如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失）中起重要作用。
　　由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的最末端，多数正常体细胞的端粒末端每经一个复制循环就进行性缩短。这一现象在体内和体外都得到证实，并且可能与高级真核生物的正常体细胞有限的繁殖能力有关。
　　这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用。与体细胞相对照，生殖细胞是永生性的，它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息。因此它必须对抗端粒缩短。这一工作通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成。
　　端粒酶是一种核糖核蛋白，它们用自身的RNA成份的互补序列作模板，催化TTAGGG重复序列加到染色体末端。在大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶活性的表达。端粒酶反应超越了细胞的增殖限制，这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。
　　传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性。由于需要大量的样品材料，且检验灵敏度受局限, 这一方法已被端粒重复扩增法（Telomeric Repeat Amplification Protocol, TRAP）所取代。
　　标准的TRAP测定是通过PCR扩增端粒酶反应的产物，使用放射性标记，经凝胶电泳后，通过放射自显影显示结果。
　　这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法：活性光密度酶联免疫测定法。这种方法具有如下特点：
　　安全，无需使用放射性同位素
　　一步反应，使用即用的混合物使端粒酶介导的引物延伸和PCR扩增可在一个试管中进行。
　　应用广泛，扩增后可适用于不同分析法。
　　灵敏，与放射性同位素TRAP测定相当。
　　可靠，准确、重复性好。
　　快速，6-8小时得到结果。

　　现介绍如下：
　　1.原理：
本法是建立在Kim等人描述的TRAP方法的基础上的，它将端粒酶介导的衍生产物进行PCR扩增, 并与后序的ELISA法结合在一起。本法可分如下几步：
（1）延伸/扩增：
第一步：端粒酶将端粒重复序列（TTAGGG）加到带有生物素标记的P1-TA引物的3’末端。
　　第二步：利用引物P1-TS和T2通过PCR扩增这些延伸出的产物，产生出的PCR产物带有特异的端粒酶-6-核苷酸的延伸产物。

（2）ELISA测定：
PCR产物变性后与Dig标记的端粒特异的重复检测探针杂交。终产物可经生物素标记的探针固定到亲和素包被的微量滴定板上。固定的PCR产物可用与过氧化物酶交联的抗地高辛复合物（anti-Dig-POD）检出。最后，经过分解底物TMB形成一种有色的反应物，再用酶标仪进行检测。

　　2.应用：
　　本法可用于从培养细胞和其他生物样品的抽提物进行端粒酶活性的高敏感性检测。

　　3.检测步骤：
　　3.1样品制备：
　　3.1.1细胞提取物的制备：
　　—按标准方法采集并进行细胞记数（trygan染色，使用血细胞计数器。）
　　—每个反应取2*10⁵细胞移入一个新的试管。
　　—2-8℃下以3000g离心10分钟形成细胞团。
　　—小心移去上清液，将细胞在PBS中重悬并重复离心步骤。
　　—小心移去上清液，细胞小团可放在-80℃下储存。
　　—若准备细胞提取物，将细胞小团在200ul裂解试剂中重悬，冰上预冷并提吸至少3次，冰中孵育30分钟。如果将冷冻细胞团用于提取，加入裂解液前在冰上融化细胞团。
　　—2-8℃，16000g离心裂解物20分钟。
　　—小心移去上清液并移入新的离心管中。保证将细胞残渣带入，我们推荐仅抽吸175ul细胞提取物。
　　—继续进行TRAP反应。
　　—如不立即进行TRAP反应，将小份细胞抽提物在液氮中休克性冷冻，将提取物储存在-80℃。
　　3.1.2组织中提取物的制备：
　　—测定端粒酶活性的组织标本准备，需要小心的采样并保存临床材料，因为肿瘤细胞的污染可产生正常组织中的假阳性信号，而由于不恰当的保存也可在肿瘤样本中产生阴性信号。如不是立即用于端粒酶PCR ELISA组织样本应以小片在液氮中休克性冷冻，并保存在-80℃。
　　—冰上孵育30分钟。
　　—2-8℃，16000g离心细胞裂解液20分钟。可用冷冻台式离心机及离心管。
　　—小心将上清液移入新的离心管中，确保无组织残片被带入，我们建议仅抽提175ul组织提取物，以标准方法测定蛋白浓度，在液氮中休克性冷冻小份组织提取物，将提取物存放在-80℃。
　　3.2端粒酶重复序列扩增步骤（TRAP反应）。
　　—对于每一待例检测样本，先将25ul反应复合物加入适合PCR扩增的管中，加入1-3ul细胞提取物（相当于1*10³-3*10³细胞或1-50ug总蛋白）。并加入无菌水至总体积50ul，所有吸取步骤在冰上进行。
　　—将离心管置于PCR仪中，照下列步骤进行引物延伸/扩增反应。

　　3.3杂交及ELISA反应流程：
　　—每个样品取20ul变性试剂加入适宜的离心管中，若有大量样本，建议使用无核酸酶包被的微孔板MTP。
　　—加入5ul扩增产物，15-25℃孵育10分钟。
　　—每个离心管内加入225ul杂交缓冲液，用振荡器完全混匀。
（如需要，杂交混合物量可以用于二次检测扩增产物。）
　　—取出100ul混合物加入试剂盒中已包被的微孔板的每个孔中，并用盖子盖住小孔以防蒸发。
　　—将MTP微孔板置于37℃，300rpm的振荡器中孵育2小时。
　　—弃去全部杂交液，以清洗缓冲液洗三次，每孔250ul每次至少30秒，小心弃去冲洗液。
　　—每孔加入100ul抗-DIG-POD工作液，用盖子盖上MTP，15-25℃（18-22℃）置于300rpm的摇床上孵育30分钟。
　　—完全弃去溶液，以每孔250ul清洗缓冲液冲洗5次，每次至少30秒，小心弃去冲洗缓冲液。
　　—每孔加入100ulTMB底物溶液预热至室温，盖上盖子，在300rmp的摇床上孵育10-20分钟。
　　——不要移去反应底物，每孔加入100ul终止试剂以终止反应。
　　注意：加入终止液后等已反应的POD底物的颜色从蓝转黄，这是取得最高敏感度所必要的。
　　——使用ELISA酶标仪，测定加入终止液后30分钟内标本450nm吸收值（参照波长为690nm）。

　　4.结果分析：
吸光值为A450nm，参照空白对照读数（A690nm）。
　　4.1阴性对照：
将细胞提取物与无DNA酶的RNA酶预孵育，降解端粒酶内源性RNA作为检测端粒酶的阴性对照，另一种方法为热处理以取得阴性对照。用RNA酶处理标本，阴性对照最大的吸收值为0.25A450nm-690nm，如果数值较高，整个实验包括TRAP反应需重新进行。
　　4.2阳性对照：
阳性对照的吸收值在底物反应20分钟后检测，应高于1.5（A450nm-A690nm），相当于使用1*10³细胞进行检测。如果数值较低，整个实验包括TRAP反应需重新进行。
　　4.3样本：
将样本的吸收值减去阴性对照的值。如果吸收值的差异（ΔA）高于0.2（A450nm-A690nm）可认为端粒酶阳性。

　　5.常见问题分析及解决方案
　　1阳性对照信号过低或无
Ø 所用热循环仪的型号不适合所设的热循环程序，选择适宜的循环条件。
Ø 引物延长、扩增所用的水含有核酸酶。必须使用无核酸酶的重蒸水（DEPC或Velcorin处理）来制备试剂。
Ø 试剂受核酸酶污染。另换阳性对照细胞提取物及样本重复全部检测。仔细检查是否污染了DNA酶及RNA酶。
Ø 孵育步骤未在300rmp振荡器下进行。选用合适的振荡器。
Ø 抗DIG-POD工作液失效，必须使用新准备的抗DIG-POD工作液，检查抗DIG-POD工作液的酶活性是否失效并准备新鲜的工作液。
2阴性对照信号过高
Ø 阴性对照、裂解试剂、或反应混合物被端粒酶阳性细胞提取物污染，以RNA酶处理或65℃热处理10分钟是阴性对照失活。重复包括扩增在内的整个实验。
Ø 阴性对照、裂解试剂、反应复合物、或其它试剂可能被以前实验的扩增产物所污染。
Ø 在检测步骤中，冲洗不充分，增加冲洗步骤。
Ø 与TMB底物溶液的孵育过长，加入TMB底物溶液20分钟内停止底物反应。
(责任编辑：泉水)

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