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核酸检测技术在常州地区献血筛查中的应用

时间:2011-07-25 10:42来源:江苏常州 作者:何亚琴,张建伟,等 点击: 593次

 

核酸检测技术在常州地区献血筛查中的应用

何亚琴,张建伟,杨爱龙,濮云峰,庄华(江苏省常州市中心血站,江苏常州213003)

 

【摘要】目的:将核酸检测技术(Nucleic Acid Technology, NAT)应用于献血者血液筛查。

方法:采用罗氏诊断cobas s 201系统对2010年4月至2011年3月的血站常规EIA检测合格献血者的53,041份标本进行HIV、HCV和HBV三项联合筛查,并对NAT筛查阳性的标本做确证试验。

结果:53,041份血液标本中,经过血清学检测,HBsAg、抗HCV、抗HIV ELISA检测均为阴性的合格血液共51,991份。其中,NAT共检出阳性53例,阳性检出率为0.1%,分项确证实验怀疑其中一例血液样本处于HIV病毒“窗口期”,追踪检测证实其HIV呈阳性。

结论:NAT系统应用于献血者血液筛查有助于减少输血性艾滋病病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)等感染情况,提高血液及输血安全。

 

【关键词】核酸检测(NAT);HIV;HBV;HCV ;血液筛查;血液安全

 

HBV、HCV和HIV的输血传播一直是国内外输血安全领域最关注的热点之一。虽然通过对血液进行输血相关病毒的抗原或抗体的检测,使输血传播疾病的发生率明显降低,但输血传播疾病仍时有发生[1]。其中,90%以上HBV和HIV的传播风险及75%以上HCV的传播风险来自于“窗口期”病毒感染[2]。现有的血清学方法(ELISA)还不能检测出处于血清转换前的“窗口期”病毒感染。而近年来发展的高度敏感、特异的核酸扩增技术——NAT技术可以将HBV、HCV和HIV病毒的检测“窗口期”明显缩短[3],减少病毒经输血传播发生率,大大提高了输血和血液制品的安全。目前这项技术已在世界上许多国家和地区广泛使用。为进一步保证输血安全,提高血液质量,本站作为卫生部指定首批15所核酸检测试点采供血机构之一,自2010年4月开始对采集的无偿献血者血液进行HBV、HCV和HIV的核酸检测(NAT),现报告如下。

 

1 材料与方法

1.1 标本来源与处理 

2010年4月-2011年3月本站共收集无偿献血者标本53,041份。所有固定捐血点配备水平离心机,采血结束后立即由采血人员完成对每位献血者4管标本的留取:分离胶促凝真空采血管(1管5ml )用于酶免四项、ALT检测;带分离胶EDTA-K2抗凝真空采血管(1管5ml、1管8ml)用于核酸检测;EDTA-K2抗凝真空采血管(1管5ml )用于血型检测;同时记录采集日期、样品编码等信息。所有标本均在2小时内经过离心后保存于2~8℃的冰箱。流动采血点在2~3小时内取回站部,全天至少三次,与检测中心交接后离心保存,在24小时内进行血清学筛查和NAT检测。

1.2 仪器 

NAT检测系统采用罗氏诊断 cobas s 201全自动核酸提取、扩增检测系统:HamiltonSTAR全自动混样仪、COBAS Ampilprep核酸提取仪及COBAS Taqmen Analyzer核酸扩增检测仪。Freedom evoclinical全自动加样仪(TECAN);FAME酶免分析仪;低速离心机(KCD);M PR 1410R冰箱(SANYOLABCOOL)。

1.3 试剂 

HbsAg  ELISA检测试剂、抗HCV ELISA检测试剂、抗HIV-1/2 ELISA检测试剂(国产试剂)。HBV、HCV和HIV核酸的提取试剂和检测试剂均为罗氏诊断公司的产品。

1.4 检测流程 

当日完成二遍ELISA(国产试剂)检测,次日上午NAT检测和ELISA复查同时进行。酶免阴性、单阳复查标本随机混合后用NAT法检测,酶免双阳标本做单标本检测。

1.5标本混合(Pooling)和检测:

每个一级混样池(pool)包含6个无偿献血者标本,每个标本取167 ul血浆至一级混样池,全自动混样仪加样。一级混样池标本采用COBAS Taqsceen MPX 检测试剂,在全自动核酸提取仪中应用MGP磁珠分离技术提取核酸,核酸扩增检测仪扩增检测HBV、HCV、HIV靶序列,在PDM服务器(罗氏诊断cobas s 201系统自带的服务器)中自动判读结果。每组检测均设置质控对照(HBV/HCV/HIV-1-O/HIV-1-M/HIV 2)。每个一级混样池均含内对照(internal control, IC)。阳性一级混样池拆分为6个组,组成该一级混样池的原始标本做单标本检测,单标本检测阳性判定为NAT阳性,单标本检测阴性判定为NAT阴性。

1.6NAT阳性标本的确证 

将NAT检测显示阳性的标本送至卫生部临检中心作HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的分项确证。

 

2 结果

2.1 血清学检测结果 

53,041份血液标本中,经血清学检测,HBsAg、抗HCV、抗HIV ELISA检测均为阴性的合格血液共51,991份。

2.2 核酸检测结果

对血清学检测为阴性的51,991份合格血液进行核酸检测,有53例核酸检测阳性( 罗氏诊断血筛试剂是HIV、HCV和HBV 3项联合检测,尚不能区分具体项目)。

其中1例混检三联检测HBV/HCV/HIV核酸,CT值为31.6,拆分三联检测HBV/HCV/HIV核酸,CT值为28.5;血站传染因子HBsAg、anti-HCV、anti-HIV、TP均为阴性;送卫生部临检中心确认HIVRNA可疑。

2.3 确认试验

将53份核酸检测阳性标本送至卫生部临检中心确认,其中9例为HBV/HCV/HIV阴性,43例HBV DNA 阳性,  2例  HCV RNA及HBV DNA阳性,1例  HIV RNA阳性(两对半检测结果见表一)。

2.4 追踪研究结果 

对上述一名怀疑感染HIV的献血者,在献血后第20天和第35天用样本的再次混样模式三联合检测HBV、HCV、HIV核酸,CT值为21.1,ELISA检测发现HIV二次检测转阳、梅毒也转阳。

根据WB 确证试验的结果,该献血者献血日标本,无带型,为阴性;献血后第20天标本带型为gp160  p24;第35天标本带型为gp160  gp120 p66 p55 gp41  p31  p24  p17,为HIV-1抗体阳性,证实为HIV感染者。

 

3 讨论

目前应用于血液筛查的NAT技术主要有Gen-Probe/Chiron公司的转录依赖扩增技术(TMA)和罗氏诊断公司的COBAS  Taqman方法[4,5]。笔者采用COBAS  Taqman方法,从51,991份ELISA检测合格的血液中采取6标本混样法,并对阳性混样池进行拆分检测。共检测出53份NAT阳性血液,经分项确证试验鉴别,怀疑其中1例为HIV阳性,提示处于感染的早期(窗口期)。对这名怀疑感染HIV的献血者于献血后20天和35天分别进行追踪检测,其HIV再次检测转阳、梅毒也转阳。本站因而成功阻止了一例带有艾滋病毒的血液制品流向医院。此外,根据9例HBV阳性(含1例HBV/HCV混合阳性)样本的跟踪实验,有3例病毒含量升高,4例降低,2例大体持平,表明COBAS  Taqman方法可检出处于窗口期不同阶段的乙肝病毒(表二)。更为重要的是病毒载量试验检出了15例病毒浓度小于12 IU/ml的乙肝样本(表一),而这15例样本最初是由6混样法检出的。这证明COBAS  Taqman  6混样法的临床灵敏度远高于其分析灵敏度(3.8X6  IU/ml)。此发现也为泰国2009年48万人份的核酸检测试验所证明[7]。此外,中国药品生物制品检定所在2010年的研究也发现,COBAS  Taqman 也能检出含量较低的核酸(1份样品HIV-1 RNA为<40cp/ml, 3份样品HBV DNA为<12cp/ml)[8]。这些研究都证明COBAS  Taqman 6混样法的临床灵敏度远高于其分析灵敏度。同时,用COBAS  Taqman  6混样法,我们也检测出了2例HCV/HBV混合感染样本(0.003%)(表一),这个比例也高于中国人群中的HCV感染比例。这再次证明了COBAS  Taqman  6混样法的临床灵敏度是非常可靠的。

作为一种新型的筛查输血传播传染病因子的检测方法,NAT技术自1993年起已先后被欧美、日本以及我国香港等近20个国家和地区用来做献血者血液筛查。目前,输血安全面临的主要风险之一就是被筛查病毒的“窗口期”;研究表明,通过NAT检测,可将输血传播HBV、HCV和HIV的酶联免疫检测“窗口期”分别由原来的50、72和22 天[6]缩短25、59和11天[9]

目前,常州城区年供红细胞12.6吨,人均用血量高达5.6毫升,居江苏省第一,并高于上海市的5.4毫升。从本站对常州市无偿献血者血液标本做的NAT试验结果看,现行ELISA筛查模式对于HIV仍具有一定的输血残余风险,而NAT技术更为敏感,可以筛查出尚属于感染“窗口期”的样本。也有研究者认为,从检测靶物质分析,ELISA指向抗原/抗体,NAT指向HIV/HCV RNA和HBV DNA,目前还没有证据明确显示病毒感染初期病毒RNA有效增值时间与抗原/抗体出现时间之间的关系,故认为两种方法的检测结果有互补之效,而不是简单的重复。

综上所述,NAT技术用于献血者血液筛查可以提高输血安全系数,保护献血者资源,保证用血安全,降低输血所引发的疾病传播的可能性。

 

表一  病毒载量实验及乙肝两对半结果

 

CAP-CTM

Cobas e601

序号

IU/ml

HBsAg

HBsAb

HBeAg

HBeAb

HBcAb

1

HBV  208

 N

N

N

N

N

2

HBV  29.7

 N

N

N

N

N

3

HBV  38.5

 R

N

N

R

R

4

HBV  43

 N

N

N

N

N

HCV <15

5

HBV 22

 N

R

N

R

R

6

HBV 25.1

 R

N

N

R

R

7

HBV 32.6

 N

N

N

R

R

8

HBV 40

 N

R

N

N

R

9

HBV 43.1

 N

N

N

R

R

10

HBV 445

 N

N

N

N

N

11

HBV<10600

 R

N

N

N

N

12

HBV<12

 N

R

N

N

R

13

HBV<12

 N

N

N

N

R

14

HBV<12

 N

R

N

N

R

15

HBV<12

 R

N

N

R

R

16

HBV<12

 N

N

N

R

R

17

HBV<12

 N

N

N

N

R

18

HBV<12

 N

R

N

R

R

19

HBV<12

 N

R

N

R

R

20

HBV<12

 N

N

N

R

R

HCV <15

21

HBV<12

 N

N

N

R

R

22

HBV<12

 N

N

N

R

R

23

HBV<12

 N

N

N

N

N

24

HBV<12

 R

N

N

N

R

25

HBV<12

 N

N

N

N

R

26

HBV<12

 N

N

N

R

R

27

HBV<20

 R

N

N

R

R

28

HBV<20

 N

N

N

N

R

29

HBV<20

 N

R

N

R

R

30

HBV<20

 N

N

N

R

R

31

HBV<20

 N

R

N

N

N

32

HBV<20

 N

R

N

N

R

33

HBV<20

 N

R

N

R

R

34

HBV<20

 N

R

N

R

R

35

HBV<20

 N

R

N

R

R

36

HBV<20

 N

R

N

N

R

37

HBV<20

 N

N

N

R

R

38

HBV<20

 N

N

N

N

N

39

HBV<20

 N

N

N

R

R

40

HBV<20

 N

R

N

R

R

41

HBV<20

 N

R

N

N

R

42

HBV<20

 N

R

N

R

R

43

HBV<20

 R

N

N

R

R

44

HIV 1000

 N

R

N

N

N

45

阴性

 N

N

N

R

R

46

阴性

 N

N

N

R

R

47

阴性

 N

N

N

R

R

48

阴性

 N

N

N

R

R

49

阴性

 N

N

N

R

R

50

阴性

 N

R

N

R

R

51

阴性

 R

N

N

N

N

52

阴性

 N

R

N

N

R

53

阴性

 N

R

N

N

R

 

表二  阳性献血者跟踪病毒载量实验及乙肝两对半结果

 

病毒鉴定CAP-CTM

跟踪病毒载量CAP-CTM

跟踪Cobas e601

序号

IU/ml

IU/ml

HBsAg

HBsAb

HBeAg

HBeAb

HBcAb

1

HBV 43
HCV <15

 -

N

R

N

R

R

2

HBV<12

HBV 49.5

R

N

N

R

R

3

HBV<12

HBV 33.5

N

N

N

R

R

4

HBV<12

HBV-

R

N

N

N

R

5

HBV 445

HBV-

R

N

N

N

R

6

HBV 32.6

HBV<20

R

N

N

R

R

7

HIV 1000

HIV147000

NA

NA

NA

NA

NA

8

HBV<12

HBV<12

NA

NA

NA

NA

NA

9

HBV<20

HBV 62.2

NA

NA

NA

NA

NA

10

HBV<20

HBV<20

NA

NA

NA

NA

NA

 

参考文献

[ 1] GB 18467- 2001, 献血者健康检查要求. 2002􀀂03􀀂01.

[ 2] Gallarda JL, Dragon E. Blood screening by nucleic acid amplification technology: current issues, future challenges. Mol Diag, 2000, 5( 1) : 11-12.

[ 3] Meng Q, Wong C, Rangachari A,et al. Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1RNA. J. Clin. Microbiol, 2001, 39:2937 - 2945.

[ 4] 任芙蓉, 刘长利, 吕秋霜, 等. 病毒核酸检测在献血者血液筛查中的应用. 中华检验医学杂志, 2004, 27( 9) : 596-599.

[ 5] 王迅, 郑岚, 张颖, 等. 核酸扩增技术( NAT )在上海血液筛查中的初步应用. 中国输血杂志, 2003, 16 ( 3) : 157-60.

[ 6] Roth WK. NAT and viral safety in blood t ransfusion.Vox Sang, 2000 , 78 (Suppl 2) : 257.

[7] Phikulsod S, Oota S, Tirawatnapong T, Sakuldamrongpanich T, Chalermchan W, Louisirirotchanakul S, Tanprasert S, Chongkolwatana V, Kitpoka P, Phanuphak P, Wasi C, Nuchprayoon C; Working Group for NAT Study in Thai Blood Donations.  One-year experience of nucleic acid technology testing for human immunodeficiency virus Type 1, hepatitis C virus, and hepatitis B virus in Thai blood donations. Transfusion. 2009, 49(6):1126-1135.

[8] 许四宏, 宋爱京, 聂建辉, 等. 两种进口HBV/HCV/HIV核酸筛查试剂的质量评价. 中国生物制品学杂志   2010 ,23(10): 1109-1112.

[ 9] Meng Q, Wong C, Rangachari A,et al. Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA. J. Clin. Microbiol, 2001, 39: 2937 - 2945.

 

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