抗体的制备方法与原理

抗体是机体免疫系统产生的能够特异性识别和结合抗原的蛋白质，在生物医学研究和临床诊断治疗中具有重要作用。本文系统介绍抗血清（多克隆抗体）和单克隆抗体的制备原理、方法及关键要点。

一、抗血清的制备

抗血清是通过免疫动物获得的含有多种抗体的血清，其制备过程包括抗原准备、动物免疫、血清采集和质量评价等步骤。

（一）免疫动物的选择

常用免疫动物包括哺乳类和禽类，如羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等。实验室常用家兔、山羊和豚鼠。选择依据抗原的生物学特性及所需抗血清量。一般制备抗免疫球蛋白抗血清多用家兔和山羊，因其免疫反应良好且血清量充足。免疫动物应适龄、健康、无感染性疾病，最好为雄性，饲养环境需稳定以减少个体差异及免疫过程中死亡的影响。以家兔为例，推荐使用体重2～3kg的纯种新西兰兔，每组3只。

（二）免疫途径

免疫途径多样，包括静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下及淋巴结内注射等。常用的是皮下或背部多点皮内注射，每点约0.1ml。途径选择依抗原的生物学和理化特性决定，如激素、酶、毒素等活性抗原一般避免静脉注射。

（三）佐剂的使用

由于个体对同一抗原反应性不同，且抗原免疫原性强弱不一，常加入免疫佐剂以增强免疫反应。佐剂不仅延长抗原在体内的存留时间，增强刺激作用，更重要的是激活网状内皮系统，增加免疫活性细胞，促进T细胞与B细胞相互作用，增强细胞免疫和抗体产生。常用福氏佐剂（Freund adjuvant），不完全福氏佐剂由羊毛脂与石蜡油按比例混合制成，完全福氏佐剂则在不完全佐剂中加入卡介苗。佐剂制备需超声混匀、高压灭菌，4℃保存。免疫前将抗原与佐剂按等体积混合制成乳剂，确保乳化完全。

（四）免疫方案

首次免疫剂量为300～500μg，后续加强免疫剂量约为首次的1/4，每2～3周一次。首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不再注射。第二次加强免疫后两周采耳缘静脉血检测抗体效价，未达预期则继续加强免疫，直至满意为止。

（五）抗血清采集与保存

以家兔为例，采血方法包括耳缘静脉或动脉放血、颈动脉放血及心脏采血。耳缘放血操作简便，可反复多次采血。采血后血液室温放置约1小时凝固，4℃过夜，离心分离血清，分装后-40℃以下冷冻保存或冻干后4℃保存。

（六）抗血清质量评价

免疫期间需定期检测抗血清效价、特异性及亲合力。效价常用放射免疫法测定，精确反映抗体浓度；大分子抗原抗体可用双向扩散法检测。特异性通过交叉反应率评估，亲合力反映抗体与抗原结合的牢固度，常用亲合常数K表示。

（七）免疫失败的原因及对策

免疫失败可能因动物种属或品系不适、抗原质量不佳、免疫原制备不当、佐剂选择或乳化不良、免疫方法及剂量不合理、动物饲养条件不佳等。针对原因应调整动物种类、抗原批次、佐剂类型、免疫方案及改善饲养环境。

二、单克隆抗体的制备

1975年，Kohler和Milstein通过将小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞融合，成功建立了杂交瘤细胞系，既能产生特异性抗体，又能无限增殖，开创了单克隆抗体技术新时代。单克隆抗体由单一细胞系产生，针对单一抗原决定簇，具有高特异性和一致亲合力，区别于多克隆抗体的多样性。

下表比较了单克隆抗体与常规免疫血清抗体的主要特性：

单克隆抗体技术的广泛应用极大推动了免疫学、分子生物学、临床诊断及治疗的发展。