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膜片钳系统

时间:2012-08-04 07:01来源:网络 作者:未知 点击: 474次

膜片钳系统

(一)Sutter P-97拉制仪

1、开左侧电源开关,预热10min

2、运行RAMP TEST坡度测试,确定玻璃管的加热值,使加热能够熔化玻璃但又不至于烧断加热片。

警告:第一次使用拉制仪或更换加热丝、更换不同型号的玻璃时,都应该作RAMP TEST坡度测试,然后把RAMP TEST的值当做新编辑的程序的HEAT值。

下面是运行RAMP TEST的步骤:

1)进入任一程序(按0-9 Enter回车)。

2)按清除键<CLR>进入控制功能。

3)按<0>不要清除参数数值。

4)按<1>即能运行RAMP TEST 坡度测试。

5)安装玻璃管和按<PULL>

6)记录RAMP TEST值,将用于设置HEAT

3、做完RAMP TEST后记下它的值按RESET。选择一个程序,按光标提示输入测试得到的HEAT值,调整PULLVELOCITYTIME等参数值,设置拉制步数(Cycle)。

4、安装玻璃管:先将玻璃管安放在一侧的玻璃管夹的槽内,用旋钮固定,然后将玻璃管推过加热小室,用另一侧的玻璃管夹固定。

5、按“PULL”键,拉制电极

6、小心取下拉制好的微电极。

7、关闭电源。

注意:

1.不能用力按压玻璃管夹!将玻璃管推入加热小室时不能碰到加热丝!

2.用户要根据自己的需要先通过RAMP TEST确定HEAT值,再不断调整PULLVELOCITYTIME值,使之做一步二步甚至多步拉制达到自己的应用目的。

(二)微操纵器操作规程

SUTTER公司MP-285微操纵器由三部分组成:Controller控制器、Rotary Optical EncodeROE)和用于固定电极的Manipulator

1、打开MP285 Controller前面板的电源

2、拧开Manipulator部分固定探头的螺丝,转出探头,装上电极

3、在MP285 Controller的主菜单按1(快进模式),按ENTER

4、按MOVMP285 Controller
5、转动ROE三个转盘推进电极
6、接近细胞后按ROE上的COARSE/FINE按钮,灯亮后以FINE模式推进电极,进行封接。
7、完成后,撤掉电极,使Manipulator回到初始状态。

(三)Digidata 1322A

打开后面板的电源按钮,前面板绿灯和黄灯亮后即可正常运行。
(四)膜片钳放大器

1、打开MutiClamp 700A的电源开关,通过双击电脑桌面的快捷图标运行MultiClamp Commander。点击主界面的Channel 1 Mode,选择Voltage ClampCurrent Clamp模式,同时MultiClamp 700A控制面板正面相应的Voltage ClampCurrent Clamp指示灯会闪烁。

2、参数设置

Commander程序面板窗口中,先用按钮Reset to Program Defaults使所有参数恢复到默认值,然后在Options中进行如下设置:

1General

aSync Output中可根据需要选择Internal commandmode

bLowpassFilter Type中全部选Bessel。滤波频率可在Commander程序面板窗口中设定,其默认值为10 kHz,根据噪声情况,一般全细胞记录可采用25 kHz,单通道选510 kHz

cGains

根据所记录电流的最大幅度选择反馈电阻,一般全细胞记录最大电流幅度在几十nA水平,故默认值为500 MΩ。单通道最大电流幅度在几百pA水平,可选550GΩ。其余不作改动。

dAuto

如果不使用钳制模式的自动转换功能,此部分无需作改动。另外,在进行串联电阻补偿时,出现振荡的解决方法也可选择降低补偿程度(选第二项)。

设置完成后可保存为*.mcc文件,还可进一步采用Quick Select功能将该文件赋予给工具栏按钮,这样下次实验时可直接调用。上述设置的钳制模式为电压钳模式。

2、准备封接

1)打开ClampexSeal Test,设定封接测试脉冲电流方波的幅度与频率。

2)在玻璃微电极内维持一定的正压,降低电极入液,在Seal Test中可见测试脉冲方波。观察电极电阻的大小。

3)用Auto调节Pipette Offset,使IpA)=0

3、封接

1)使电极逐渐接触细胞。当电阻突然增大,电流降低1/3以上时,去除正压并轻轻给予负压吸吮以形成稳定封接。封接形成后,封接测试脉冲消失,仅出现电极电容瞬变值。

2)观察封接电阻的大小,一般膜片钳记录要求封接电阻在1 GΩ以上。

3)补偿电极电容:用Cp FastCp Slow对电极电容进行补偿。

4)漏电流(封接电流)的去除:单通道记录可选Leak Subtraction功能。建议采用ClampexP/N Leak Subtraction功能。

5)经过上述步骤就形成了细胞贴附式单通道记录模式。如要形成内面向外式,还需将膜片撕下。如要形成外面向外式或全细胞记录,还需打破细胞膜。

4、破膜

1)继续给予负压吸吮或用Zap功能电击打破细胞膜。

2)破膜后,缓慢撤除电极内的负压。

3)进行膜电容补偿:选上Whole Cell,用Auto对膜电容进行补偿,必要时用手工进行细微调节。

4)进行串联电阻补偿:选上RsCompensationDisable if oscillation detected(或Reduce if oscillation detected),增大PredictionCompensation对串联电阻进行补偿。

注:若要形成外面向外记录模式,可在步骤(2)后,缓慢地上提玻璃微电极,封接处附近的细胞膜会从细胞上脱离下来并自动融合。此时不用执行步骤(3)和(4)。

5、记录

关闭Seal Test。选择设定好的Clampex采样软件的Protocol,开始记录细胞电信号。注意:

1)如果记录的基线不在零,可选Output Zero,用Auto对基线归零。

2)如果噪声过大,可降低滤波频率。

3)漏减功能最好选择Clampex中的P/N Leak Subtraction功能。

4)细胞膜钳制电位也要使用Clamprx中设定的钳制电位。

5)若单通道的电流幅度较小,可通过增大Gain获得满意的窗口显示。

注意:

1、充灌微电极时,只要电极内液液面能够和银丝相接触即可,过多的电极内液可能会溢出污染电极夹持器,还会增大导电半径,从而增大记录噪声。充灌完成后,用滤纸吸干残留在电极尾端的电极内液。

2、静电排除:冬季因气候干燥容易产生静电,为防止手上带静电,应先触摸接地的金属物体(如屏蔽网或显微镜),然后再触摸放大器探头。

使用显微镜时注意保护物镜镜头,避免刮伤。

 

 

(责任编辑:泉水)
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