膜片钳记录系统简介：膜片钳技术是细胞电生理方面的高端技术，是研究细胞膜离子通道的重要工具。目前细胞膜离子通道的研究已经应用到了药物作用、环境对细胞膜离子通道的影响、神经网络研究以及疾病的诊断和治疗等多个领域。膜片钳技术是神经科学、心血管、药物学和药效学、功能基因组学和许多遗传病深入研究的有力手段。

主要设备：PC-2B放大器、AXON200B放大器、正置显微镜、倒置显微镜、NIR-DIC成像系统、水镜头、微操纵器、微电极拉制仪、抛光仪、振动切片机等。
仪器功能及应用范围：单细胞膜片钳记录（急性分离细胞、培养细胞）、脑片膜片钳记录（盲法、可视法）

脑片膜片钳实验流程(PC-2
一、脑片制作
1.  配制新鲜蔗糖溶液（4°C）和NaCl孵育液（室温，20~25°C）各1L。
2.  用丙酮浸泡刀片30 min。
3.  麻醉动物：爪蟾—MS-222，大鼠—乌拉坦。
4.  解剖动物，取脑组织。
5.  切片：根据不同的动物和组织选择不同的方案。
方案一：低熔点琼脂包埋组织后进行切片。
方案二：普通琼脂作托进行切片。
6.  处理脑片：蔗糖溶液中40～60min（4°C或32°C）。
7.  孵育脑片：NaCl溶液中放置0.5~1h（室温）后可进行膜片钳实验。
注：脑片制作过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。

二、全细胞膜片钳记录
（一）盲法
1.  将脑片置于灌流槽内，用银丝压牢，并确保灌流系统通畅、稳定。
2.  双手接触屏蔽罩以释放操作者身体静电。
3.  打开放大器POWER→ON，记录模式选择SEARCH档。
4.  打开IBBpatch-clamp软件，点击 按钮，监测电流及电阻变化。
5.  系统holding选择 -50~ -80mV。
6.  安装玻璃微电极。
7.  用注射器给电极内施加适度正压。
8.  降低电极入水，并接近脑片。
9.  封接：用微操纵器推动电极接触脑片，并逐渐向脑片深处推进，当电阻突然增大，电流降低1/3以上时，释放注射器内正压，缓慢抽吸，逐渐形成千兆欧姆封接（gigohm）。
10.  破膜：轻拉注射器，突然出现大的电容电流，表明已破膜，Whole-cell 模式形成。
11.  迅速点击 按钮，记录模式选择VC档。
12.  点击 按钮，可观察电流变化，但是不记录、不保存。点击 按钮，可观察并保存电流变化。
（二）可视法
基本步骤同盲法，不同的是需要在步骤8之前打开监视器的DVCView软件，在水镜头下找到目的细胞后再将电极入水，逐渐接近脑片直至到达该细胞，在可视的情况下完成后续步骤。

单细胞膜片钳实验流程(AXON200
一、单细胞急性分离
一般过程为：解剖→切片→孵育→消化→洗酶→吹打→细胞贴壁。
以急性分离大鼠海马神经元为例叙述如下：
1.  配制人工脑脊液(ACSF) 250ml。
2.  解剖：断头取脑，在冰冷（0~4°C）ACSF中取出海马。
3.  切片：将海马沿矢状位切成400~600μm厚的脑片。
4.  孵育：脑片在ACSF中室温下孵育50min。
5.  消化：将孵育后的脑片移入酶消化液中，32°C消化25min。
6.  洗酶：用ACSF洗脑片3次。
7.  吹打：依次用口径递减的三个吸管轻轻吹打脑片，制成单细胞悬液。
8.  贴壁：将单细胞悬液竖直静置5min，吸取上方细胞悬液加到培养皿中，约30min后细胞贴壁，即可进行膜片钳实验。
注：细胞急性分离过程需全程通入95%O2+5%CO2混合气。

二、全细胞膜片钳记录：
单细胞膜片钳实验需要在倒置显微镜下进行，其步骤与脑片膜片钳记录过程基本相同。由于可直接看到细胞，故可以将微电极直接接近并接触目的细胞，完成封接、破膜等一系列过程。软件设置和放大器操作不同之处主要有以下几点：
1.  按下放大器POWER，记录模式选择Vm档
2.  进入记录软件：开机后按F8键进入MS-DOS系统→ 输入“cd pclamp6”命令 → 输入“clampex / fetchex”进入记录界面。
3.  File选择预先设定好的刺激参数。
4.  Trial → TestSeal 监测电流变化，进行封接和破膜，形成全细胞模式。
5.  记录模式选择VTRACK档
6.  Trial → View 观察电流变化，但是不记录、不保存。
7.  Trial → Record可观察并保存电流变化。

拉制仪操作流程
采用两步法拉制玻璃微电极：
1.  打开电源POWER(-)，预热10min。
2.  调节拉制参数。
第1步拉制参数：将左侧旋钮旋置NO.1 HEATER，再旋转右侧第一个旋钮NO.1 HEATER ADJ，调到所需参数。
第2步拉制参数：将左侧旋钮旋置NO.2 HEATER，再旋转右侧第二个旋钮NO.2 HEATER ADJ，调到所需参数。
注：调节参数过程的动作要迅速，持续时间不宜过长。
3.  将左侧旋钮置于STEP2位置。
4.  安装电极，将加热丝旋到上方，按START，完成第一步拉制。
5.  将加热丝旋下，待加热丝完全变暗后，按START，完成第二步拉制。
6.  关闭电源POWER(○)。