第十六章　常用分析技术在临床生物化学中的应用

第一节　光谱分析技术的应用

　　一、光谱分析技术的分类

　　利用各种化学物质（包括原子、基团、分子及高分子化合物）所具有的发射、吸收或散射光谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。根据光谱谱系的特征不同，可把光谱分析技术分为发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类。

　　在临床生化检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。应用吸收光谱原理进行分析的主要有可见光及紫外光分光光度法，以及原子吸收分光光度法。红外分光光度法虽然也属于吸收光谱法，但在临床生化上应用不多。应用发射光谱原理进行分析的主要有荧光分析法和火焰光度法。应用散射光谱原理进行分析的主要是比浊法，包括免疫比浊法等。

　　二、光谱分析的常用方法

　　（一）吸收光谱分析法

　　1、可见光及紫外光分光光度法

　　（1）标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。

　　（2）对比法：将标准样品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。由于测定体系温度、厚度以及入射光波长是一致的，所以标准与待测样品K值及L相等，可应用下式比较计算待测样品浓度：Cx=Cs×As／Ax。

　　（3）差示法：有色溶液浓度太浓或太稀（透光度超过90%-10%）时，测定结果会产生较大误差，此时可采用差示法（differential spectrophotometry)。①高浓度样液差示法：用标准品制备浓度稍低于试样的参比溶液，先将仪器光门关闭，调节T%=0，再将参比溶液置于光路上，打开光门使T%=100，然后测定样品溶液的透光率即可。例如某一样品溶液原来的透光率读数为5%（10%以下），用差示法后读数为50%，这实质是把透光率标尺扩展了10倍，从而减少了测量误差。②低浓度样液差示法：用标准品制备浓度稍高于试样的参比溶液，将它放在光路上，打开光门，调节透光率至0%，然后换以空白溶剂，调节刻度至100%。此后测定样品的读数即可。

　　（4）多组分混合物的测定：当试样中有两种或两种以上的组分共存，可根据各组分的吸收光谱的重叠程度，选用不同的定量方法。如果混合物各组分的吸收峰互不干扰，这时可按单组分的测定方法，选择测定波长，分别测定各组分的含量；若各组分的吸收峰相互重叠，可采用解联立方程法、等吸收点法、双波长法等解决量中的干扰问题。

　　（5）利用摩尔吸光系数进行检测：①吸光系数：Beer定律的数学表达式为A=kbc，若溶液的浓度c以g/L为单位，b为光径以cm为单位，则常数K称为吸光系数，以a表示，其单位为升/（克·厘米）[L/(g·cm],A=kbc可写成A=abc。②摩尔吸光系数：公式A=kbc中的以为1mol/L,b为1cm时，则系数k称为摩尔吸光系数，以ε表示，单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]，A=kbc可写成A=εc。在实际工作中，不能直接用1mol/L这种高浓度的溶液测定吸光度，而是在稀释成适当浓度时测定吸光度进行运算。ε值与入射光波长、溶液的性质等因素有关。如NADH在260nm时ε为15000，写成ε₂₆₀^NADH=15×10³；在340nm时ε为6220，写成ε₃₄₀^NADH=6.22×10³。③比吸光系数：如公式A=kbc中的c是百分浓度（w/v）b为cm，则常数k可用E^%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数，A=kbc可写成A=E^%bc。当待测物的化学结构是已知者可用ε值分析，若所测物的化学结构是未知的，则ε无法确定，此时用比吸光系数分析就很方便。a、ε和E常用作粗定量分析，主要用于定性分析。

　　近年来由于新的灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂不断出现，一般不经分离过程即可直接比色测定。几乎所有的无机离子和有机物都可直接或间接用可见光及紫外光分光光度法进行定量测定。

　　2、原子吸收分光光度法　原子吸收光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中，待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。具有灵敏度高、选择性好、操作简便、分析速度快等优点，对大部分元素，其灵敏度约为10^-8～10^-10g/ml，是微量元素检测的一个十分有铲的方法之一。

　　（1）分析条件的选择

　　1）分析线：原子吸收法中常选择待测元素的共振作分析线，但并不是任何情况下都应使用共振线，例如As、Se、Hg的共振线在远紫外区，该区域火焰吸收强烈，不宜选用共振线作分析线。在选择分析线时，首先扫描空心阴极灯的发射光谱，然后喷入试样溶液，观察谱线的吸收和干扰情况，一般选用不受干扰且吸收最强的谱线作为分析线。常用元素分析线见表16-1。

表16-1　常用元素分析线

　　2）狭缝宽度的选择：适宜狭缝宽度可由实验确定：将试样喷入火焰，调节狭缝宽度，测定不同狭缝宽度时的吸光度，达到一定宽度后，吸光度趋于稳定，进一步增加狭缝宽度，当其他谱线或非吸收透过狭缝时，吸光度立即减小。不引起吸光度减小的最大狭缝宽度，就是最适宜的狭缝宽度。

　　3）原子化条件的选择：对于火焰原子化法，火焰的种类和燃助比的选择是很重要的。当燃气和助燃气选择好后，可通过下述方法选择燃助比：固定助燃气流量，改变燃气流量，测量标准溶液在不同燃助比时的吸光度，绘制吸光度-燃助比关系曲线，以确定最佳燃助比。

　　对于石墨炉原子化器的使用。应注意干燥是一个低温去溶剂的过程，可在稍低于溶剂沸点的温度下进行。灰化是为了破坏和去除试样基体，故在保证试样无明显损失的前提下，将试样加热到尽可能高的温度。原子化阶段应选择最大吸收信号的最低温度。总之，根据试样的性质确定各阶段所选定的温度与加热时间。

　　4）试样量的选择：火焰原子化法在一定范围内，喷入的试样量增加，原子吸光度增大，但在超过一定量后，由于试样不能完全有效地原子化及试液的冷却效应会使吸光度不再增大甚至有所下降。因此在保持一定的火焰条件下，测定吸光度随喷入试样量的增加达到最大吸光度时的喷雾量，就是适宜的试样量。石墨炉原子化一般固体取样0.1～10mg，液体取样量为1～50μl，主要依石墨管容器的大小而定。

　　（2）定量方法：常用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标法。

　　1）标准曲线法：同紫外可见标准曲线法。但由于燃气流量和喷雾效率的变化，单色器波长的漂移等因素可导致样品测试条件与标准曲线测定条件不同，所以，在测定未知样品时，应随时对标准曲线进行检查，每次实验都要重新制作标准曲线。

　　2）标准加入法：在标准曲线法中，一般情况下要求标准溶液和未知溶液的组成保持一致。但在实际工作中不是总能做到的，采用标准加入法可以克服这个缺点。本法把未知试样溶液分成体积相同的若干份，留其中一份，其余分别加入不同量的标准样品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准样品加入量为横坐标绘制标准曲线（图16-1）。由于未知样品中含待测组分，故直线不通过原点而是在吸光度高于原点的A₀处与纵轴相交，且直线外推法使工作曲线延长交横轴处于B点，则OB所对应的浓度Cx就是未知试样中待测组分浓度。

图16-1 标准加入法工作曲线

　　标准加入法的优点是能够更好地消除样品中其它成分对测定的影响。

　　3）内标法：在系列标准样品和未知样品中加入一定量试样中不存在的元素（内标元素），然后测得As和Ax，以As/Ax比值对标准样品中待测元素浓度C绘制标准曲线，再根据未加内标元素的试样A与加入内标元素的试样As比值（A/As）即可在标准曲线上求得试样中待测元素浓度。

　　本法要求内标元素应与待测元素有相近的物理和化学性质。此外，内标法只适用于双通道型原子吸收分光光度计。

　　（二）发射光谱分析法

　　1、荧光分析法　许多物质都是光致发光的，即它们可以吸收电磁辐射，然后又重新发射出相同或较长波长的辐射。光致发光最常见的类型是荧光（fluorescence)和磷光（phosphorescence）。利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法（fluorimetry)。在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称发射光。荧光法测定的是受光激发后所发射的荧光的强弱，而不是测定激发光的强弱。凡能产生荧光的化合的，均可采用荧光分析法进行定性或定量。

　　（1）荧光强度的影响因素

　　1）溶剂：增大溶剂的极性，将使π-π^※跃迁的能量降低，荧光增强。在水、乙醇、环已烷等这些常用溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须在使用前作净化处理。

　　2）荧光物质的浓度：对于某一荧光物质的稀溶液，在一定频率和一定强度的放射光Ⅰ。照射下，如果光被吸收的百分率不太大，且溶液的浓度很小，当溶液的厚度不变时，则它所发生的荧光强度F和该溶液的浓度C成正比，即F=φⅠ。ECL式中φ为荧效率。当荧光物质浓度高时，会发生分子间碰撞，使荧光效率降低。因为温度增高后使分子间碰撞次数增加，消耗分子的内部能量。

　　3）温度：大多数情况随温度升高时，荧光效率降低。因为温度增高后使分子间碰撞次数增加，消耗分子的内部能量。

　　4）溶液的PH值：当荧光物质本身为弱酸或弱碱时，溶液的pH值改变对溶液荧光强度产生影响较大，因为有些物质在离子状态时无荧光，而有些则相反，也有二者均有荧光，但荧光光谱有所不同。

　　（2）荧光定量分析法：荧光定量分析法通常有标准对比法和标准曲线法。操作和计算可参照比色法，但应注意，空白溶液的荧光强度F。往往不在零点，用上述两种方法时应先测定F，再从标准品Fs和试样Fx中减去F。后进行计算。