为了探索肌动蛋白体外大尺度自聚合结构体系,我们利用原子力显微镜———一种已广泛应用于肌动蛋白结构、功能及动力学研究的新型表面结构分析仪器[23 ] ,对肌动蛋白体外自组织纤维结构进行了研究,发现肌动蛋白在没有F-actin 稳定剂(如鬼笔环肽) 存在的情况下,能够通过自组织过程形成离散的、树状分支的纤维丛和具有不同直径的长纤维结构;与Shao Z , 等人实验中,肌动蛋白在鬼笔环肽介入下形成由单根微丝和微丝束构成的大范围连续网络结构明显不同[24 ] 。这暗示,作为微丝工具药物而广泛应用的鬼笔环肽可能对肌动蛋白大尺度结构形态有较大的影响。

1 　材料和方法

1. 1 　材料

G-actin 提取自牛骨骼肌,纯化按照Spudich 和Watt 等人的方法[25 ] 。分离的肌动蛋白达电泳单点

纯,储存于4 ℃的G-缓冲液中备用;Na2ATP、DTT 购自Sigma ,Tris-base 、Tris-HCl 购自Promega , 其余试剂均为国产分析纯;CSPM-2000we 型原子力显微镜为中国科学院化学研究所本原纳米仪器有限公司生产,使用NANOPROBETM NP 型Si3N4 探针。

1. 2 　方法

1. 2. 1 　溶液配制　G-缓冲液( 2mmolPL Tris-Cl ,pH7. 5 , 0. 2mmolPL CaCl2 , 0. 5mmolPL DTT , 0. 2mmolPL ATP) 和F-缓冲液(5mmolPL Tris-Cl , pH7. 5 , 2mmolPLMgCl2 , 100mmolPL KCl , 1mmolPL DTT , 1mmolPLATP) 均按常规方法制备,所有使用的溶剂和新鲜配制的溶液均通过<0. 22μm 的滤膜过滤去除颗粒。

1. 2. 2 　待测样品制备　用F-缓冲液将1ml 纯化G-actin 精确稀释至100ml ,使溶液中G-actin 的最终浓度为5μgPml ,然后将样品置于37 ℃恒温箱中孵育30min 使其聚合。聚合完成后,在新鲜剥离的云母表面滴加5μl 待测溶液,使其自然脱水制成待测样品。

1. 2. 3 　原子力显微镜成像　样品制备完成后不经过任何物理和化学处理,立即在室温下(25 ℃) 用原子力显微镜的接触模式成像。原子力显微镜采集的图像保存为BMP 格式,储存在电脑中做进一步的分析。上述所有操作均在超净工作条件下进行,以避免污染。