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慢性疼痛基因治疗的研究现状和展望

时间:2006-03-26 18:56来源:anesthesia.org.cn 作者:bioguider 点击: 1783次
东方肝胆外科医院 尤圣武 审校 俞卫锋
 

  慢性疼痛的形成机理极其复杂,主要为痛觉调制系统和神经可塑性的改变,已有的治疗手段如药物治疗、针灸治疗和交感神经切除术的长期效果都很差。基因治疗是90年代发展起来的一种先进的治疗手段,尽管针对慢性疼痛的基因治疗大多数仍处于动物实验研究阶段,只有少量的临床前期报道。但是,相对于传统的治疗方法,基因治疗仍具有明显的优点:1. 转基因表达的蛋白能定向的由靶控的器官或相邻组织以持续的或可诱导的方式合成和分泌,直接作用于细胞本身或邻近细胞,避免了临床常规药物的半衰期问题。2. 临床药物常需要高剂量才能起作用,因而带来显著的副作用,如药物依赖和中毒] ,基因治疗可以避免这些副作用。3. 目的基因直接针对疼痛的调制和神经元可塑性改变的某些重要环节,如感觉神经元抑制性递质分泌减少和局部神经元抑制性受体表达下降] ,兴奋性氨基酸和神经肽以及NMDA受体的高表达 ,选择性更强。目前许多动物实验证实转基因对痛觉过敏具有治疗作用。本文主要就慢性疼痛基因治疗的基本问题:目的基因的选择和确保转基因治疗时效的策略作一简单的综述。
1. 目的基因的选择
  已有的慢性疼痛临床治疗和实验研究,大多针对痛觉调制系统和疼痛形成的外周机制,阿片类药物和NMDA受体拮抗剂已被证明镇痛效果比较确实。目前的基因治疗策略也是针对这两个方面。随着对疼痛机制研究的深入,慢性疼痛基因治疗的目的基因谱也相应扩大。
  1.1 阿片肽基因:吗啡等阿片类镇痛药对急慢性疼痛的确切临床效果,促进了阿片受体及其内源性配体的发现。已发现的阿片肽家族包括脑啡肽、强啡肽、β内啡肽、孤啡肽和内吗啡肽。
  1.1.1脑啡肽(enkephalin):包括蛋氨酸脑啡肽和亮啡肽,对δ受体的选择性较强,被认为是δ受体的内源性配体。前脑啡肽原基因编码263或267个氨基酸残基的前脑啡肽原,经酶切加工出蛋氨酸脑啡肽和亮啡肽,作用于δ、μ、κ受体。脑啡肽主要由脑内和下行痛觉调制神经元以及肾上腺髓质表达,在中枢脑啡肽是重要的镇痛介质,许多抑制性递质通过脑啡肽介导的阿片受体作用发挥镇痛效应。已有多个研究小组构建携带前脑啡肽原基因的HSV-1型重组单纯疱疹病毒,通过足底皮肤接种,能特异提高脑啡肽主要是蛋氨酸-脑啡肽在小鼠和大鼠脊髓后角神经元DRG的表达,抑制C纤维对辣椒素和二甲亚砜刺激的敏感性,对福尔马林引起的慢性炎性疼痛具有抗痛敏作用,实验表明:这种转基因表达的脑啡肽在疼痛信号弱时释放不增加,而在强烈刺激时才有大量的释放。此外,已证实这种携带前脑啡肽原基因的单纯疱疹病毒不仅对大鼠坐骨神经部分损伤模型产生的痛觉过敏具有治疗作用,而且对吗啡耐受的慢性疼痛仍然具有镇痛效果[20],而纳洛酮拮抗实验可以翻转这种镇痛效应,证明这种效应是阿片受体介导的。因此,前脑啡肽原基因是慢性疼痛基因治疗的一种相对理想的选择。
  1.1.2 β-内啡肽(beta-endorphin):β-内啡肽由POMC基因编码的β趋脂素经蛋白水解酶PC2水解产生,对μ和δ受体均有较强的亲和力,因此,它的镇痛效应要比脑啡肽强。在脊髓蛛网膜下腔内注射β-内啡肽,除了可以直接作用于μ受体外,还可以通过结合脊髓后角的ε受体促进脑啡肽分泌而产生强镇痛效应。在中枢神经系统内只有腺垂体和下丘脑的神经分泌细胞分泌通路细胞器中含有PC2水解酶]能够产生成熟的β-内啡肽,而感觉神经元和中间神经元不能分泌β-内啡肽。β-内啡肽的表达特点限制了直接使用前体基因进行基因治疗。如果直接转染外周神经元进行基因治疗,并不能分泌成熟的β-内啡肽。因此,采用β-内啡肽作为目的基因需要考虑未成熟肽的水解和成熟肽的分泌机制。为了解决这个困难,目前大多采用人工合成的携带某种其他分泌蛋白信号肽或前导肽的融合基因,利用这些信号肽的促进分泌和稳定蛋白的功能,通过直接基因治疗或间接基因治疗载体系统产生成熟的β-内啡肽。首先是Beutle A S.等将小鼠神经生长因子前导肽与β-内啡肽编码基因的融合,用这种融合基因重组的逆转录病毒转染NIH3T3细胞,培养基中可检测到高浓度的β-内啡肽,而对照组并未检测到表达[23]。Alan A. Finegold, et al 采用这种融合基因重组的非增殖型腺病毒,经大鼠脑脊液注射后,大部分病毒转染注射部位附近的软脊膜细胞,三天后脑脊液中的β-内啡肽的浓度达到正常大鼠和人脑脊液中β-内啡肽浓度的10-20倍,能够有效的抑制炎性痛觉过敏的痛反应。这两个小组的工作提示可以利用旁分泌(这与脑脊液内移植嗜铬细胞分泌β-内啡肽镇痛的原理基本相同)的机制在相应节段脊髓的软膜细胞转染目的基因载体,利用目的基因的信号肽或前导肽在软膜细胞中被信号肽酶或相应的蛋白水解酶水解,如Furins酶能识别pp-NGF-β-内啡肽融合蛋白中的特异氨基酸序列,从而分泌成熟的β-内啡肽。另一种方法是将融合基因整合到细胞载体基因组上,通过脑脊液内转染细胞达到分泌β-内啡肽的目的,其原理与上一组基本相同。因此,选用更好的前导肽序列将有助于扩展旁分泌途径在慢性疼痛基因治疗中的应用。
  1.1.3强啡肽(dynorphin):强啡肽由前强啡肽原基因编码,经酶切加工出强啡肽和强啡肽B,脑内和脊髓神经元都可分泌。强啡肽是κ受体的特异性配体。在脊髓水平,强啡肽的作用存在比较复杂。生理水平的强啡肽起镇痛作用,同时它能维持其他阿片肽在脊髓的镇痛效应,而在脊髓损伤和坐骨神经损伤时脑脊液中的强啡肽水平明显升高,研究表明,强啡肽能通过NMDA受体诱导脊髓损伤。许多慢性疼痛动物或病人脑脊液内强啡肽水平并未减少,相反,随着疼痛时间延长,强啡肽的水平越高。由于强啡肽在脊髓痛觉调制中的双重作用,目前仍未见有采用强啡肽用于疼痛基因治疗的报道。能否选用前强啡肽原基因作为目的基因还要进一步的基础研究,以避免发生脊髓神经元损害。
  1.1.4孤啡肽(ORQ):1994发现脑内存在一种阿片受体样受体(ORL),这是一种孤儿受体,广泛分布于外周和中枢神经系统。1995年找到这种受体的内源性配体孤啡肽(OFQ)。孤啡肽的氨基酸序列结构与强啡肽比较相似,都是17肽,但它对δ、μ、κ受体的亲和力很弱,对孤儿受体亲和力强。孤啡肽可引起痛敏,脑室内微量注射可导致大鼠痛阈降低基因,并且可以抑制吗啡的抗伤害镇痛效应。因此作为的目的基因还需大量相关的基础研究。
  1.1.5内吗啡肽(endomorphin): 1997年Zadina JE等发现脑内存在一种四肽氨基酸,对μ受体具有高选择性、强效的亲和力,它的氨基酸序列是Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2,主要分布于脑内,以后根据EM-1特异抗体又找到结构 类似的EM-2,主要分布于脑内和脊髓内,与前者的区别在于第三位上的氨基酸改为Phe,它对μ受体的亲和力比EM-1更高。脑和脊髓蛛网膜下腔内注射内吗啡肽或类似物,可产生明显的镇痛效应[31],对于炎性疼痛的治疗作用更为明显,对于神经痛EM也能有效镇痛,同时对吗啡耐受的大鼠神经痛仍具有效果。因此,这是一个比较合适的治疗顽固性疼痛的分子。但是,目前内吗啡肽的分泌机理仍然不清楚,编码基因仍未克隆,因此只能采用直接注射疗法,而直接注射似乎很容易产生耐受[31]。
  1.2 神经营养因子家族
  神经营养因子(Neurotohpic factors, NTFs)属于细胞因子家族,是一类能够促进特定神经组织细胞分化、再生,刺激神经递质释放并且能改变神经元特性的蛋白分子。NTFs不仅可作为靶源性逆向营养因子影响上一级神经元,还可顺轴突和突触影响其远端的靶细胞或通过旁分泌和自分泌发挥局部作用。NTFs包括神经营养因子(神经生长因子NGF、脑源性神经营养因子BDNF、神经营养因子3NT-3、NT-4/5),类胰岛素生长因子ILGF,睫状神经营养因子CNTF,胶质细胞源性神经营养因子及其相关蛋白[32]。目前用于基因治疗的NTFs家族成员主要是脑源性神经营养因子BDNF,BDNF多见于中枢神经组织,包括脑和脊髓。除了诱导神经突起定向生长,决定感觉和交感神经纤维生长方向等NGF所具有的效应外,它还具有运动神经元营养活性,能保护脊髓运动神经元在SCI后免于死亡。采用注射BDNF能提高神经损伤后运动神经元的存活率,阻止神经切断所应起的运动神经元的凋亡和退变,并明显促进坐骨神经的再生。神经营养因子对神经元的保护作用可能一部分是通过阻止神经元发生凋亡的过程来实现的,尤其是在损伤后引起的延迟性神经元凋亡中发挥着重要作用[33]。另外,BDNF还可以通过阿片受体作用和其他脊髓抑制性受体通路激发脑啡肽和GABA等抑制性递质的释放,对于主要是由于神经元局部缺血损伤或毒性改变引起的神经痛,采用神经营养因子BDNF进行基因治疗可有效减轻疼痛以及神经痛的其他症状[34]。此外,采用神经生长因子和CNTF治疗神经元损伤也有报道。
  1.3 细胞因子
  目前已经明确的可用于慢性疼痛基因治疗的免疫调节性细胞因子有IL-2,中国科学院上海生化所刘新垣组发现IL-2具有中枢和外周镇痛作用,IL-2不仅是一种重要的免疫调节因子,而且是中枢神经系统内一种重要的神经调节分子。IL-2和IL-2受体广泛分布于大鼠中枢神经系统,主要位于海马、下丘脑、小脑、新纹状体和脊髓背角神经元。刘、赵等报道了IL-2在中枢和外周神经系统都具有镇痛效应,在脊髓后角通过结合阿片受体抑制痛觉信号产生镇痛效应。研究显示人IL-2氨基酸序列上的Phe44, Tyr45, Tyr107, 和 Phe117 是主要镇痛基团。IL-2在中枢神经系统中通过降低下丘脑前叶的活性和抑制海马的长时程强化以及诱导海马的去极化发挥抑制效应。脑室内、海马或局部核团内注射IL-2可以提高痛阈。这种效应与侧脑室周边的下丘脑核团或局部的核团亮啡肽分泌增加,导水管周边SP分泌增加以及背角浅层Fos蛋白合成减少有关。但是, IL-2蛋白在体内的半衰期极短,使用IL-2镇痛并不可行。因此他们在进一步研究中分别研究使用真核表达载体和腺病毒载体介导的IL-2基因治疗,结果显示IL-2基因对慢性神经痛具有显著的镇痛效果,同时通过鞘内注射方式取得的效果要优于皮下给药,这种效应可持续4周,同时这种效应可以被纳络酮部分阻断,提示IL-2可以通过阿片受体以外的机制影响痛觉的调制。他们的工作为IL-2调节神经系统功能开拓了一条全新的领域,也为慢性疼痛的基因治疗开创了一个新的方向。将来有可能进入临床应用。
  1.4 反义核苷酸
  主要针对中枢兴奋性调制系统的高敏。涉及NMDA受体、PKCγ蛋白、SP受体、钙通道以及快钠通道的功能改变。反义核苷酸主要针对这些受体设计。具体的描述见有关综述。
  1.5 RNAi
  1995年,康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义和正义RNA都阻断了基因的表达,单作用机理仍然不清。直到1998年, Andrew Fire的研究证明,在正义RNA也阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预(RNA interference, RNAi)。随后的研究中发现,RNAi现象广泛存在于线虫,果蝇,斑马鱼,真菌以及植物等生物体内,在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也成功阻断了基因的表达。近几年RNAi的研究取得了很大进展,相继于2001 和2002年被《Science》杂志评为十大科学成就。
  RNAi的作用机理主要通过一种小片段干扰性双链RNA作为效应分子催化与靶基因mRNA结合的级联反应而减少mRNA的含量,干扰目的基因的表达。 SiRNA可以作为一种引物,在RNA 依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA,后者被Dicer酶的作用下被裂解后又形成新的SiRNA,新形成的SiRNA,又进入上面的循环。这个过程称为随机降解多聚酶链反应,从反应特点来看,具有正反馈放大效应,因此,只要有少量的SiRNA产生,既可导致靶mRNA的渐进性减少,出现基因沉默现象,也就是关闭了某个基因的功能。
  与反义核苷酸不同的是SiRNA是双链RNA,不仅反义链有干扰功能,正义链也有同样作用,而且去除正义链,则干扰作用消失。目前抑制基因表达常采用反义技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争。这两种方法对基因表达的抑制都不如RNAi高效特异持久。目前已经报道的dsRNA能阻断99.7%的细胞中调控细胞周期的关键基因CDK-2的表达。因而,RNAi在某个基因表达异常增高引起的疾病如病毒感染,肿瘤等的治疗可能有用。而痛觉过敏与NMDA受体和其他兴奋性递质受体上调有关,因此,RNAi可能成为将来疼痛治疗研究的热点,近期已有相关的报道。目前RNAi在非脊椎动物如线虫,果蝇,以及植物中的应用已经取得了很多重要的成果,但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段,在哺乳动物身上还没有成功的实验报道。同时,如何将双链RNA高效特异的转入体内仍是一个难题。
2. 确保有效转染的策略
  2.1选用合适的载体:已用于慢性疼痛基因治疗的载体各有其优缺点,有关载体的选择资料见两编综述。由于病毒本身的一些特性,如组织亲和力、包装和复制、是否整合染色体、宿主免疫反应等方面的不同,在表达的时效和安全性方面有很大的差异。细胞移植由于选用细胞的组织来源受限和免疫排异反应,目前还需进一步研究。非病毒载体如脂质体、基因枪等的转染效率低下,目前还没有技术上的突破。因此,我们主要介绍病毒载体和细胞载体方面的一些研究进展。
  2.1.1病毒载体
  2.1.1.1 单纯疱疹病毒(HSV):属于双链DNA病毒,最大的优点是嗜神经性,缺点是神经毒性大。由于部分人群本身携带单纯疱疹病毒,复制缺陷型疱疹病毒在体内可能获得复制所需的必需基因,发生神经细胞溶解。目前,多IE基因剔除株(ICP4-:ICP22-:ICP27-)的制备已经获得成功,这种病毒的毒性和免疫应答比单基因剔除株弱,而神经亲和力并不受影响。已经用于临床前期研究。
  2.1.1.2腺病毒(AdV): 属于双链DNA病毒,优点是能感染分裂和非分裂细胞,高滴度制备容易,对人体的毒害作用轻微。缺点是免疫源性强,目的基因表达时间短。随着载体研究的不断深入,二三代腺病毒的免疫源性显著降低,能有效延长目的基因的时效。同时,通过外壳蛋白改造,使病毒对特异组织的亲和力不断提高,有效保证转基因的效率。另外,利用整合病毒如AAV和逆转录病毒的相关元件与腺病毒基因组重组构建的嵌合病毒,有效整合人体染色体,保证目的基因的长期表达。
  2.1.1.3腺相关病毒(AAV):AAV属于微小病毒科,优点是有效整合宿主细胞染色体,可同时表达多个目的基因,免疫反应轻,转基因表达时间长达6个月以上。缺点是插入区小,最大只能插入4-5Kb的片段,制备时需要辅助病毒,易含有野毒,而且高滴度制备困难。此外,整合基因可能导致宿主基因突变从而引起癌变,安全性方面还需进一步的研究。外周转染病毒可以通过神经元轴突进入神经元,而鞘内注射大多感染脑膜细胞和神经胶质细胞,已有许多用于中枢神经系统疾患如针对帕金森氏症的治疗研究。慢性疼痛方面报道很少。AAV的研究进展主要在两个方面,一是目前高滴度制备工艺取得突破,可达到1013VP/ml,另外,与腺病毒构建嵌合病毒已获得成功[52]。
  2.1.1.4逆转录病毒(RTV):第一种应用于临床病人治疗的病毒就是逆转录病毒,用于ADA缺乏导致的先天性免疫缺陷病人。逆转录病毒的一个缺点是病毒整合是随机的整合,并不能作到定点整合,因此,有可能受到基因组的干扰而出现转染沉默现象。
  2.1.1.5其他病毒载体:此外,慢病毒类载体如HIV病毒也能达到长期的基因表达,有可能用于慢性疼痛的治疗。
  2.1.2 细胞移植
  属于间接基因治疗范畴。最早的细胞移植载体选用的是人的或牛的肾上腺嗜铬细胞,通过蛛网膜下腔内转染,依靠嗜铬细胞本身具有分泌儿茶酚胺类物质,特异性作用于中枢神经的α2肾上腺素能受体,通过该受体的镇痛通路发挥作用。但是个体本身细胞来源的限制,而异源细胞免疫源性强,容易激发宿主免疫反应从而导致排异反应,使治疗效应短暂而且不确实。以后发展了采用不死细胞作为载体,通过基因克隆技术使这种细胞可以分泌阿片肽、GABA或儿茶酚胺[57-59],通过不同的痛觉调制通路发挥镇痛效应。这种细胞可以转染不同的目的基因,相对于初期对于神经痛的治疗更为有效。另一方面考虑到宿主抗外源细胞免疫反应对细胞移植的影响,采用生物材料将细胞微囊化,也就是用在细胞外层包裹选择性通透的生物膜,将细胞的抗原隐蔽起来,这样宿主的T淋巴细胞就不能识别外源细胞,降低了免疫反应的程度和发生几率,有利于延长基因治疗的时间。虽然,目前细胞移植治疗已有临床Ⅱ试验的报道,但是细胞载体以及生物材料在人体脑脊液内对神经元细胞的影响仍然还需要进一步的研究。
  2.1.3其他载体
  基因枪或裸DNA技术以及真核表达载体目前都还处于初期研究阶段,只有少量的研究报道。
  2.2选用高效或特异的启动元件
  2.2.1启动子(Promoter) (enhancer)
  选用合适的启动子/ 增强子是病毒基因治疗的关键因素。强效启动子能明显增强转染的效果、延长目的基因表达的时程。这方面主要以HCMV(人巨细胞白血病病毒启动子)和MCMV(小鼠巨细胞白血病病毒启动子)为代表,MCMV是目前最强的一种启动子,能高效启动目的基因在各种组织细胞中的表达,相对于其他启动子,可以明显减低基因转染所需的病毒量而不会影响表达效果[62],因此,强效启动子至少可以减少高滴度病毒带来的潜在的神经元损害问题,有利于提高基因治疗的安全性。另一种是组织特异性启动子,它能增强病毒表达的选择性,同时能获得有效的免疫逃避效果,从而延长病毒基因表达时间。痛觉主要由脊髓中枢和上脊髓中枢调制,而脑脊液内转染病毒主要感染神经中枢外周的脑膜组织,并不能感染或很少感染神经元细胞,非选择性启动子即使活力再强,也不能增加中枢内部神经元的转基因表达,而且每一种启动子在不同的中枢神经元中的活性也相差很大,从而削弱了基因治疗效果。而选择性的启动子可以通过内部感染的神经元表达目的基因,而周边的脑膜细胞并不表达,靶向性明显提高。目前发展的多种神经元特异的启动子如人synapsin-1 基因启动子,大鼠特异烯醇酶(NSE)启动子等都能选择性的在神经元内调控基因表达。
  2.2.2沉默子(Silencer)
  选用特异沉默子构建的重组病毒,确保目的基因只能在这些细胞中特异表达,减少载体感染其他组织细胞后可能造成的副作用。 Millecamps S等将神经元特异的沉默子元件(NRSEs)克隆到磷酸甘油酸激酶启动子上游,用这一启动元件构建腺病毒转染神经细胞和非神经细胞,报告基因只在神经元中表达,而非神经细胞并不表达或表达量极低。由于中枢神经系统内免疫反应相对较弱,提高表达的特异性有利于降低免疫系统从其他组织获得抗原而促发全身免疫反应,延长病毒在神经元细胞中的表达时程。
  2.3抑制宿主免疫反应:如何抑制宿主抗载体免疫反应一直是当前基因治疗的研究重点。宿主免疫反应除了减低转基因表达效果和时程外,还介导自身的炎症反应,引起靶细胞的损害。尽管中枢神经系统的免疫反应较全身免疫反应轻,但载体抗原或转基因蛋白仍可激发体液免疫和细胞免疫,以免疫源性最强的腺病毒为例,一次鞘内注射,21天后动物脑内可观察到明显的CD8+细胞、MHC-1分子、小胶质细胞和巨噬细胞聚集,而在外周血中也可检测到高滴度的抗病毒血清,这种病毒抗原可能是通过蛛网膜颗粒外溢。因此,二次或多次注药后,将激发更强烈的免疫反应,导致转基因治疗快速失效。
  抑制宿主免疫反应的关键在于关闭淋巴细胞反应,传统的免疫抑制方案如口服或注射免疫抑制剂、全身应用抗体以及去除T淋巴细胞等都会导致对机体整体免疫的非特异性抑制,毒副作用大。随着自身免疫耐受机制逐步阐明和对野生病毒免疫逃逸策略的认识以及相关功能基因的发现,对抗宿主自身免疫的方法也越来越多。
  2.3.1免疫耐受
  由于神经系统与全身免疫系统存在解剖屏障,因此,免疫耐受策略主要针对成熟淋巴细胞。主要策略为阻断抗原提呈,包括阻断MHC分子以及多肽的合成、装配、转运与表达,可以消除淋巴细胞活化所需的第一信号。其次,阻断第二信号的传导,导致淋巴细胞无能(anergy)。如修饰肽配体(APL)可占据T细胞受体,但是不能正常传导刺激信号,导致T细胞无反应功能. 第三,使淋巴细胞因“忽略”而死亡,致使活化的淋巴细胞缺失,这种“忽略”死亡是由于淋巴细胞缺乏适当频度的刺激,不能表达抗调亡蛋白(主要是Bcl家族),而引起的被动性死亡[70]。第四,限制T细胞的增殖和分化,如可溶性CTLA4Ig可竞争性结合B7受体,干扰CD28/B7-1、B7-2信号途径的作用,抑制T细胞增殖。Nakagawa et al 构建的携带CTLa4Ig腺病毒载体,能够有效抑制中和抗体的产生,延长其他腺病毒载体的报告基因表达时间,而且在二次使用报告基因载体时,仍可获得满意的表达。目前最为常用的方法是口服或胸腺内应用病毒抗原,诱导中枢和外周免疫耐受,此外,换用不同血清型的载体也可减轻重复使用的免疫反应,其他方法还有待进一步的研究。
  2.3.2免疫逃避
  经过长期的进化,人源性病毒大多具有抵抗宿主强大免疫反应的对策,主要针对MHC-I抗原提呈这一环节,具体表现为以下几个方面:第一,病毒下调MHC-I类分子的表达,或者通过表达某种蛋白改变和阻断MHC-I类抗原的提呈途径,如HIV病毒编码的Nef蛋白可下调MHC-I复合物的合成,从而减少MHC抗原向T细胞提呈[72]。其次,病毒通过抑制胞浆内蛋白酶的作用,影响T细胞表位的形成,使MHC/多肽复合物形成减少,如HCMV病毒磷酸蛋白PP65可抑制T细胞表位的产生,从而抑制T细胞活化[73]。第三,阻留或破坏MHC-I类分子。腺病毒E3基因表达的19KI型膜糖蛋白分子能通过其胞浆末端介导ER驻留信号迫使MHC-I类分子滞留在细胞浆内,使抗原复合物不能转运到细胞表面,因此,保留E3区的某些基因可有助于减轻免疫反应[51]。此外,病毒还可通过Jak/Stat信号途径影响MHC-II类基因转录活化因子,进而抑制MHC-II的表达。因此,利用人源性病毒与免疫逃避有关的基因序列(如腺病毒的E3区),或者剔除基因组中编码强免疫源性蛋白的基因组(如腺病毒的E4区),重组构建新一代载体,将有利于目的基因的长效表达。此外,动物源性的载体在人体内通常不引起免疫反应[74,75],因此,动物源性病毒载体将是今后慢性疼痛基因治疗的研究方向。
2.3.3人工免疫隔绝
  T细胞的活化和增殖分化都需要抗原提呈,如果用人工材料隔绝载体抗原与T细胞接触,尽管目的基因产物仍可能诱发免疫反应,这种免疫反应也相对轻微。例如,使用微囊包裹移植细胞,再移植入脑脊液中用于中枢系统疾病的治疗,已经取得明显的临床效果[60]。病毒载体可用脂质体等包裹后转染。
2.3.4联合应用
  联合应用免疫耐受、免疫逃避和免疫抑制剂可能更好地解决宿主的免疫反应难题。
3.总结和展望
  慢性疼痛作为一种世界性的难题,现有的临床治疗策略都存在很大的缺陷,基因治疗为慢性疼痛的治疗开拓了新的领域。目前基因治疗主要针对难治的顽固性疼痛如慢性神经痛和晚期肿瘤痛,对于炎性疼痛由于阿片类药物的长期疗效还比较理想,只是作为产品鉴定和对照研究的对象。因此,理想的基因治疗效果应对难治性疼痛有效并且对发生阿片类药物耐受的慢性疼痛仍然具有疗效。而选用的方案应该是:利用人体某些特异的细胞来表达在慢性疼痛发挥重要作用的蛋白的编码基因,选用合适的无害的载体又能避免引发宿主免疫反应,而且载体的制备相对容易。同时特异启动子和/或相关调控元件能够长效调控目的基因的表达,或者采用能够特异杀灭或阻断某些异常表达神经元活动而对正常神经元传导无损害的治疗策略。随着慢性疼痛机制研究的逐步深入,有效治疗基因的出现和新一代载体的构建,相信能为许多慢性疼痛患者带来福音。

(责任编辑:泉水)
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