染色体结构显示和检测

1）  染色体显带

显Q带法

1.      漂洗：取经过干热预处理或已老化的染色体标本，置于pH6.0缓冲液中浸5~10分钟。

2.      染色：浸入pH6.0的GM或QD染液中5~10分钟。

3.      漂洗：浸入新鲜pH6.0缓冲液中漂洗两次，每次5分钟。

4.      观察：向标本染色体面滴1~2滴新鲜缓冲液，覆以盖片（避免出气泡），置荧光显微镜下观察。

显G带法

胰酶-Giemsa混合显带法

1．预处理：取中期染色体标本，置60℃～60℃温箱中20～30分钟，或在37℃温箱过夜，然后浸入0.025M磷酸缓冲液中，pH6.8，56℃温浴10分钟。

2．消化和染色：用现配制的胰蛋白酶-Giemsa混合液消化和染色10～30分钟，混合液按如下比例配制：

0.025 M 磷酸缓冲液pH6.8           73.0 ml

甲醇                                 27.0 ml

Giemsa干粉                          50.0 mg

0.25%胰酶                           0.3～0.4 ml

3．封片：染色后用自来水冲洗，入蒸馏水漂洗数次、晾干、二甲苯透明2~3分钟，封入中性树脂中。

Giemsa显带法

1．预处理：将标本置入60~80℃温箱或烤箱中20~30分钟，亦可在37℃温箱过夜。

2．胰酶消化：用0.85%的NaCl配制0.25%胰蛋白酶溶液消化3~5分钟。

3．染色：取出标本片，先直立于吸水纸上除去多余胰酶液后，随即置入Giemsa染液中，染10分钟。

4．封片：自来水洗，蒸馏水漂洗，晾干，二甲苯透明2~3分钟，封入中性树胶中。

2）  姐妹染色单体分化染色

BUdR掺入和制片程序

1．BUdR培养液制备：先制备好含BUdR的培养液（最终浓度为3~10微克/毫升）。

2．BUdR掺入：如用传代细胞，在末次传代后，改换用含BUdR的培养液培养。如为人末梢血细胞，一开始就用含BUdR培养液培养（培养瓶放在特制黑色木盒、黑布中或黑纸包裹）37℃温箱内培养。

3．中止掺入与制片：待细胞经历两个细胞周期（人周围血细胞培养48或72小时）

4．加秋水仙素—制片。

姐妹染色单体分化染色

方法一

1．老化：中期染色体标本老化1~2天。

2．预处理：放入预热至85~89℃的1 M NaH2PO4处理15分钟。

3．制片：然后用温蒸馏水轻轻漂洗，蒸馏水冲洗，晾干，Giemsa液染色10分钟，晾干，二甲苯透明，封固。

方法二：即FPG法

1．标本：掺入BUdR后的中期染色体标本。

2．荧光染色：用荧光染料Hoechst 33258（用pH7.0 Sorensen缓冲液配制，浓度为0.5微克/毫升）染色12~15分钟。

3．黑光灯照射：自来水冲洗，加1滴pH8.0 缓冲液，覆以盖片，用黑光灯照射（20 W），距离5厘米，时间半小时。

4．温浴：50~60℃热的2×SSC液温育2小时，蒸馏水冲洗，晾干。

5．染色：pH6.8的2%Giemsa染色15分钟，透明封固。

方法三

1．标本：掺入BUdR后的中期染色体标本，置30瓦日光灯下，灯距3厘米，照射6小时。

2．温浴：用2×SSC液（60℃）处理15分钟。

3．Giemsa染色10分钟，也可获得满意的标本。

3）  染色体脆性位点的检测

为提高检出率，可采取以下措施：

1．在培养时把血清量降到5%。

2．用不含叶酸的MEM-Fra培养基培养。

3．PH调至7.5。

4）  微核检测

方法一：

1．采血：静脉采血0.5ml，肝素抗凝，用小方瓶培养，加培养液5ml。培养液租成为：含20%小牛血清的Eagle液，加PHA 40微克/毫升。

2．培养：置37℃温箱内培养48或72小时，以1000rpm离心8分钟。

3．固定：3：1甲醇/冰醋酸固定3次，每次15分钟，离心沉淀固定液。

4．制片：冷冻载片滴片法制片，自然干燥，10%Giemsa（pH6.8）染色15分钟。

方法二

1．采血：肝素抗凝血0.5~0.6ml，置10ml试管中，加入血量一半的0.5%甲基纤维素，充分混合。

2．培养：置37℃温箱中静置培养30分钟，以2000rpm离心10分钟，去上清液。

3．制片：做涂片，Wright法染色。

方法三

1．采血：用三棱针刺无名指取血0.6ml，立即注入内径3mm，长5cm的血液沉淀管中，用小玻璃棒搅拌除去纤维蛋白。

2．加明胶：加入3%的明胶，小心混匀，置37℃温箱自然沉降50分钟。

3．吸去上清液，离心，沉淀物涂片，自然干燥，Wright染色30分钟，再用Giemsa染色2分钟。

5）  非程序DNA合成检测（UDS）

放射自显影UDS的测定：

1．细胞培养：WI-38成纤维细胞，完全培养液支持物盖片培养法培养，细胞生长至汇合时。

2．抑制DNA合成：弃旧培养液，加入不含精氨酸的EMEM培养液，继续培养20~24小时。

3．加测试物：加入10mM羟基脲（阳性对照加MNNG），培养2小时。

4．H-TdR处理：2、3、4每皿内加3H-TdR后，培养20~24小时。

5．漂洗：去除培养液，用不含钙、镁BSS漂洗。

6．制片：制备放射自显影标本方法固定细胞、涂胶、曝光、显影及染色。

7．观察：在油镜下计数，首先要排除S期半保留复制细胞（为银粒覆盖的细胞核），只计数核上的银粒数目，再扣除本底，结果以银粒数/核的均值或含10个银粒左右细胞的百分率表示。

液闪计数法：

1．细胞培养和处理：人二倍体成纤维细胞：接种在培养皿中培养。

2．加培养液、MNNG、羟基脲，以及3H-TdR处理等于前5项相同。自（5）漂洗后。

3．消化：用0.25%胰蛋白酶消化，制成悬液。

4．液闪计数标本制备：10%三氯醋酸处理，将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上，无水乙醇脱水烤干，置液闪杯中，加闪烁液，置液闪计数仪上计数。结果以dpm/106细胞或cpm/每皿细胞表示。