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膜片钳技术及其在心血管研究中的应用

时间:2012-08-05 09:29来源:网络 作者:未知 点击: 408次

 

膜片钳技术及其在心血管研究中的应用

中国心脏起搏与心电生理杂志 2000年第2期第14卷 综述

作者:喻卓 周兰清

单位:昆明医学院第一附属医院心内科,云南昆明 650032

  中图分类号 R331.3+8  文献标识码 A

  文章编号 1007—2659(2000)02—0127—03

  80年代初发展起来的膜片钳技术(patch clamp technique)[1]为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。该技术的兴起与应用,使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解,而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新,同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。本文拟对膜片钳的基本原理及在心血管研究中的应用作一综述。

  1 膜片钳技术基本原理与特点

  膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴,两者的区别关键在于:①膜电位固定的方法不同;②电位固定的细胞膜面积不同,进而所研究的离子通道数目不同[1,2,3]。电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变,并迅速控制其数值,以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究,特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极,对细胞损伤很大,在小细胞如中枢神经元,就难以实现,又因细胞形态复杂,很难保持细胞膜各处生物特性的一致。

  膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封,其阻抗数值可达10~100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。由于此阻值如此之高,故基本上可看成绝缘,其上之电流可看成零,形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。此密封不仅电学上近乎绝缘,在机械上也是较牢固的。又由于玻璃微电极尖端管径很小,其下膜面积仅约1 μm2,在这么小的面积上离子通道数量很少,一般只有一个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少,可以忽略,也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略,那么,只要保持电极内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变,从而实现电位固定。

  另外,高阻封接技术还大大降低了电流记录的背景噪声,从而戏剧性地提高了时间、空间及电流分辨率,如时间分辨率可达10 μs、空间分辨率可达1平方微米及电流分辨率可达10-12 A。影响电流记录分辨率的背景噪声除了来自于膜片钳放大器本身外,最主要还是信号源的热噪声。信号源如同一个简单的电阻,其热噪声为

  σn=4Kt△f/R

  式中σn为电流的均方差根,K为波尔兹曼常数,t为绝对温度,△f为测量带宽,R为电阻值。可见,要得到低噪声的电流记录,信号源的内阻必需非常高。如在1kHz带宽,10%精度的条件下,记录1pA的电流,信号源内阻应为2 GΩ以上。电压钳技术只能测量内阻通常达100 kΩ~50 MΩ的大细胞的电流,从而不能用常规的技术和制备达到所要求的分辨率。

  2 膜片钳记录的几种形式

  高阻封接问题的解决不仅改善了电流记录性能,还随之出现了研究通道电流的多种膜片钳方式。根据不同的研究目的,可制成不同的膜片构型[2,3]。

  2.1 细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面上,形成高阻封接,在细胞膜表面隔离出一小片膜,既而通过微管电极对膜片进行电压钳制,高分辨测量膜电流,称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整性,这种方式又称为细胞膜上的膜片记录。此时跨膜电位由玻管固定电位和细胞电位决定。因此,为测定膜片两侧的电位,需测定细胞膜电位并从该电位减去玻管电位。从膜片的通道活动看,这种形式的膜片是极稳定的,因细胞骨架及有关代谢过程是完整的,所受的干扰小。

  2.2 内面向外膜片(inside-out patch) 高阻封接形成后,在将微管电极轻轻提起,使其与细胞分离,电极端形成密封小泡,在空气中短暂暴露几秒钟后,小泡破裂再回到溶液中就得到“内面向外”膜片。此时膜片两侧的膜电位由固定电位和电压脉冲控制。浴槽电位是地电位,膜电位等于玻管电位的负值。如放大器的电流监视器输出是非反向的,则输出将与膜电流(Im)的负值相等。

  2.3 外面向外膜片(out-side patch) 高阻封接形成后,继续以负压抽吸,膜片破裂再将玻管慢慢地从细胞表面垂直地提起,断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。这种膜片形式应测膜片电阻,并消除漏电流和电容电流。整个过程要当心是否形成囊泡。如果浴槽保持地电位水平,膜电位即与玻管电位相等。如放大器是非反向的,放大器的输出将与Im值相等。

  2.4 全细胞记录构型(whole-cell recording) 高阻封接形成后,继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式称为“全细胞”记录。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。在电压钳条件下记录到的大细胞全细胞电流可达nA级,全细胞钳的串联电阻(玻管和细胞内部之间的电阻)应当补偿。任何流经膜的电流均流经这一电阻,所引起的电压降将使玻管电压不同于细胞内的真正电位。电流愈大,愈需对串联电阻进行补偿。全细胞钳应注意细胞必需合理的小到其电流能被放大器测到的范围(25~50 nA)。减少串联电阻的方法是玻管尖要比单通道记录大。

  2.5 四种膜片构型的比较 见附表。

附表 四种膜片构型的优、缺点比较

分型    优点    缺点    

细胞贴附式 不需灌注,不干扰胞浆,调制系统完整 不能改变细胞内介质,需用另一电极测量膜电位

内面向外式 膜两则均可接近,细胞内离子或调节物

  质的浓度可变,可向膜内表面加酶 实验中膜外介质不能改变,需低Ca2+液灌流以防

  囊泡形成

外面向外式 膜两则均可接近,不需浴灌注,外部物

  质浓度可变 实验中膜内介质不能改变,微管内需低钙以防囊

  泡形成

全细胞式 可改变内部介质以分离电流,因低电阻,

  单管电压钳制可行 内部介质需交换,直径大于30~40 μm的细胞难

  以钳制

  3 膜片钳技术在心血管研究中的应用

  二十余年来,由于电压钳和膜片钳的应用,人们对心血管活动的认识不断更新和深入,不但使心血管本身的理论更加完善,而且推动了心血管的病理生理学、药理学和临床诊治技术的发展。迄今为止在心脏就发现不下十种离子通道,仅钾通道就有九种类型以上。由此可见,心脏功能的复杂性无不与其分布着众多的离子通道有关。同样,在心血管活动的研究中,由于膜片钳的应用,人们不仅对血管平滑肌电生理机制有了更多的了解,也大大促进了高血压、动脉粥样硬化等研究的深入。

  3.1 对心肌及血管平滑肌细胞膜离子通道的研究得到更进一步深入

  自Noma[4]于1983年在心肌细胞膜上首次发现ATP敏感的钾通道(KATP)以来,KATP在心肌缺血损伤的病理生理机制中的作用越来越引起了人们的关注。实验证明在生理条件下,心肌细胞内的ATP浓度为毫摩尔水平,这一浓度能明显抑制KATP通道。ATP/ADP比率轻度变化时,只有为数很少的KATP通道开放。因此,在生理条件下KATP通道未必起作用。但在缺血和其他代谢抑制的情况下,KATP通道即被明显激活。据Cole等[5]报道,预先给予格列苯脲可加重缺血再灌注损伤,实验研究表明冠脉内注射开放剂Cromakalin或Pinacidil可拮抗缺血所致的去极化,增加静息膜电位,使缺血所致心室颤动发生率降低和心肌梗死面积减少,甚至可恢复到缺血前水平。这些结果表明KATP通道开放对缺血再灌注心肌有保护作用。然而,急性心肌缺血时KATP通道激活所致的细胞外钾堆积是诱发严重室性心律失常的主要原因。因此,KATP通道激活也有其不利的方面。

  Furakawa等[6]对猫心外膜下和内膜下延迟整流钾电流(Ik)进行了比较,发现前者的Ik激活很快而失活则延迟,充分激活Ik的幅值和电流密度也较心内膜下高得多,他认为可能由于心内膜与心外膜所受压力不同所致。Kilborn等[7]测定了不同生长期(出生后1~10天)鼠心室肌外向电流变化,认为出生一天的小鼠心室肌细胞动作电位时程比生后10天的小鼠长,原因在于出生一天的小鼠心室肌细胞背景钾电流快失活成分少,慢失活成分多,瞬间外向钾电流通道对钾离子选择性低,两者导致动作电位时程延长。

  3.2 对心肌细胞收缩、舒张机理的进一步探讨

  哺乳动物心肌细胞膜去极化时,细胞外液Ca2+由钙通道进入细胞内,启动细胞兴奋收缩耦联。由于Ca2+通过钙通道内流是细胞兴奋收缩耦联的首要条件,因此研究Ca2+和钙通道及其调控为进一步阐明兴奋收缩耦联机制具有重要意义。O′Neill等[8]应用膜片钳和荧光探针两种方法进行研究后认为咖啡因可使鼠心肌细胞钙内向电流增加,流入胞浆的Ca2+诱导肌质网钙释放成为心肌收缩时胞浆内钙升高的主要原因。

  3.3 在血管壁张力改变机理研究中的应用

  大部分小动脉一般都以收缩状态的形式存在,它们进一步收缩或舒张主要依赖于血液的需求量。在微循环中,小动脉的平滑肌张力对外周血管阻抗及血压起着决定性作用。近年来应用膜片钳技术对血管平滑肌上的钙通道及钾通道进行了不少研究,迄今为止在平滑肌上已发现四种不同类型的钾离子通道[9]:①电压依赖性钾通道;②钙激活性钾通道(Kca通道);③内向整流性钾通道;④KATP。动脉平滑肌细胞上膜电位是动脉张力及动脉直径的主要调节者,而实验证明细胞膜电位主要是由钾离子通道来控制。动脉平滑肌细胞膜上钾离子通道开放可促进钾离子外流增加,并导致膜电位超极化,由于膜电位超极化的影响,结果膜上电压依赖性钙通道关闭,Ca2+内流减少,从而导致血管平滑肌舒张。许多内源性血管扩张剂如降钙素基因相关肽(CGRP)和adenosine等主要是通过激活ATP敏感性钾通道使平滑肌细胞超极化,降低血管壁张力,维持血管舒张状态。Wilde等[10]对成年犬冠状动脉游离的平滑肌细胞的研究中发现KCa通道能直接对抗Ca2+通道活动所致的膜去极化而引起膜超极化,提示这个通道可能在对抗冠脉平滑肌的去极化和紧张性中起着重要的保护作用。内毒素性休克出现的低血压现象可能与钾离子通道的过度激活有关。钾通道阻断剂将可使动脉平滑肌细胞膜去极化及血管收缩。事实证明TEA、ChTX、Iberiotoxin可使肌源性脑动脉及大鼠隐静脉收缩。降低血管内压力或阻断Ca2+通道以降低细胞内Ca2+浓度,并以此来降低主动脉张力,这将大大削弱钾通道阻断剂对膜电位和动脉张力的作用[11]。因此,血管平滑肌钾离子通道功能改变会导致一系列脉管系统疾病,如血管痉挛、高血压、心肌缺血以及内毒素性休克时出现低血压、糖尿病出现的血管反应性改变等。

  3.4 在心血管药理学研究中的应用

  随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用,对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新,而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路”[2]。

  膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素,研究它们对通道功能的可能影响。通过研究,一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理;另一方面,分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。近十年来心血管药物学研究最重要的成就就是首先合成了各类钙拮抗剂(如硝苯砒啶、硫氮?酮和维拉帕米及其衍生物)[12],随着其在临床上不断应用,人们逐渐发现钙拮抗剂尽管有一定疗效,但其负性肌力作用及反射性交感兴奋作用是其缺陷。因此目前人们普遍认为进一步开发作用于钾离子通道的药物更为理想。但由于钾通道的类型较多,药物对通道的选择性很重要,Ik被认为是理想的药物作用靶子。Ⅲ类抗心律失常药如索他洛尔、溴苄胺、二甲苄胍、UK68798、BTHP及新开发药E-4031等均可延长APD,减少复极时的外向电流,实验表明这些药物的抗心律失常、抗心室颤动作用与它们阻滞心肌细胞膜Ik密切相关。另外,在某些情况下,药物对KATP的影响、对心律失常及心肌缺血的发生和预后可能产生重要作用。如单细胞膜片钳实验证明RP49356、Cromakalim、Pinacidil可激活心肌细胞膜KATP。在犬心房肌,Cromakalim、Pinacidil、Nocrandil产生负性肌力作用的PD2值分别为6.11,3.37,4.55。Pinacidil及Cromakalim等对离体的缺血心脏有保护作用,其机理是由于开放了KATP,用优降糖可完全对抗它们对再灌流的保护作用。钾通道开放剂的临床评价还在探索阶段,但此类药物近期疗效肯定,降压而不减少肾血流量,扩张冠脉但不引起冠脉“盗血”现象,因而具有良好前景,如新近研制及开发的一批新药NS-400、EMD52692、Nicorandil等[13,14,15]。

  4 结束语

  膜片钳技术的创立取代了电压钳技术,是细胞电生理研究的一个飞跃,使得离子通道的研究,从宏观深入到微观,使昔日的“肉汤生理学(broth physiology)”与“闪电生理学(lightning physiology)”在分子水平上结合起来,使人们对膜通道的认识耳目一新。当前,生理学、生物物理学、生物化学、分子生物学和药理学等多种学科正在把膜片钳技术和膜通道蛋白重组技术、同位素示踪技术和光谱技术等非电生理技术结合起来,协同对离子通道进行全面的研究。不少实验室已经将基因工程与膜片钳技术结合起来,把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究。设想将合成的通道蛋白分子接种入机体以替换有缺陷和异常的通道的功能而达到治疗的目的。作者简介:喻卓(1969—),男(汉族),河南潢川人,讲师,硕士,主要从事细胞电生理研究及心血管病介入治疗。

  参考文献

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  2,Neher E,Sadmann B.The patch clamp technique [J].Sci Am,1992,266(3):44

  3,Sigworth FJ.The patch clamp is more useful than anyone had expected [J].Federation Proc,1986,45:2 673

  4,Noma A.ATP-regulated K+ channels in cardiac muscle.Nature (London) [J],1983,305:147

  5,Cole WC,Mcphersosn CD,Sontas D.ATP-regulated K+ channels protect the myocardial against ischemia/reperfusion damage [J].Circ Res,1991,69:571

  6,Furakawa T,Kimura S,Furukawa N,et al.Potassium rectifier currents differ in myocytes of endocardial and epicardial origin [J].Circ Res,1992,70:91

  7,Kilborn MJ,Fedida D.A study of the developmental changes in outward currents of rat ventricular myocytes [J].J Physiol,1990,430:37

  8,O′Neill,Eisner DA.A mechanism for the effects of caffeine on Ca2+ release during diastole and systole in isolated rat ventricular myocytes [J].J Physiol,1990,430:519

  9,Nelson MT,Quayle JM.Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle [J].Am J Physiol,1995,268:C799

  10,Wilde DW,Lee KS.Outward potassium currents freshly isolated smooth muscle cells of dog coronary artery [J].Circ Res,1989,65:1 718

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  12,Reuter H,Opie LH ed.Calcium Antagonists and Cardiovascular Research [M].New York:Raven,1984.43-49

  13,Richer C,Prat P,Mulder P,et al.Cardiovascular and biological effects of K+ channel openers,a class of drug with vasorelaxant and cardioprotective properties [J].Life Science,1990,47:1 693

  14,Grover GI,Mccullough JK,Henry DE,et al.Anti-ischemic effects of the potassium channel activators pinacidil and cromakalim and the reversal of these effects with the potassium channel blocker [J].J Pharmacol Exp Ther,1989,251:98

  15,Sargent CA,Grover GJ,Antonaccio MJ,et al.The cardioprotective,vasorelaxant,and electrophysiological profile of the larger conductance calcium-activated potassium channel opener NS-400 [J].J Pharmacol Exp Ther,1993,266:1 422

1999-04-17收稿

 

(责任编辑:泉水)
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