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膜片钳系统的电学噪声、机械震动、和机械漂移的分析与处理

时间:2012-08-05 08:50来源:网络 作者:未知 点击: 369次

膜片钳系统的电学噪声、机械震动、和机械漂移的分析与处理

 

摘 要: 膜片钳单通道记录系统是电生理研究的重要工具,目前已经发展成为复杂的光机电联合应用系统。在应用过程中普遍存在着电学噪声干扰(膜片钳系统各个环节的噪声)、机械干扰(记录电极尖端的震颤或缓慢漂移)。本文详细讨论并分析了这些问题,并给出有效的解决方案,对整个系统进行了优化。

关键词: 膜片钳,电学噪声,机械震动,电极漂移

膜片钳单通道记录系统是研究细胞膜(或人造膜)等双分子层上嵌合通道通透性的重要工具[1]。越来越多的实验室引进了膜片钳记录设备,广泛用于细胞膜离子通道电流的测量、细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、细胞生物学、分子生物学等各个方面[5]。

膜片钳系统已经从传统的膜片钳电学检测系统发展成为复杂的联合检测系统,包括膜片钳单细胞记录系统、膜电容记录系统、光解释放系统、荧光测钙系统,加药灌流系统,显微操作系统等多个子系统[4]。各种噪声和干扰的处理也变得更复杂了。我们曾经在国内的许多膜片钳实验室进行过安装和噪声处理。本文就膜片钳系统中普遍存在的电学噪声干扰(膜片钳系统各个环节的噪声分布)、机械干扰(记录电极尖端的震颤或缓慢漂移)等问题进行了详细分析,并给出了有效的处理方案,希望能对广大从事膜片钳技术的科研人员有所帮助.

1. 电学噪声干扰分析及处理

电学噪声可分为放大器内部的内源噪声和来自放大器以外的外源噪声。内源噪声一般都是非常低的,例如德国HEKA公司的EPC-9,EPC-10的噪声指标:探头输入端悬空,放大器Bessel滤波器,带宽选择DC-3 kHz,噪声< 0.08 pA rms[8]。而美国Axon公司的AxoPatch200B使用探头制冷技术,在相同条件下,噪声更可低达< 0.06 pA rms[6]。

我们把其他的电学噪声都可归类为外源噪声,这是膜片钳系统中主要面临的噪声。我们从放大器探头输入端开始记录观察,可发现随着插上电极夹持器、插上玻璃微电极、再放置到样本上方、入水进行封接等步骤的进行,外源噪声在逐级增加。我们可把外源噪声归类为:辐射噪声,地环路噪声,磁感应噪声[2]。

1.1 辐射噪声及其处理措施

这是一类主要的噪声。主要包括:实验室各种照明灯源和电源插座的工频噪声(50Hz);计算机的高频噪声;各种发射设备例如手机的射频噪声等。辐射噪声可以通过接地的导电屏蔽层来隔断辐射路径进行削减。使用屏蔽笼可有效地屏蔽实验系统外部大部分空间辐射噪声。更详细的处理措施见本文后面的讨论。

1.2 地环路噪声及其处理措施

屏蔽层阻挡隔离噪声保护了探测设备,而屏蔽层本身却因为承受了辐射噪声而积累了电荷,这些电荷需要通过“接大地”来释放。在屏蔽层的形成过程中,我们有时也借用了“接地”这个术语,其实际的含义是将所有屏蔽部分用金属导线连接起来,形成等电位的屏蔽层以降低电荷流动形成的噪声,然后将所有连接在一起的屏蔽层与放大器的信号地相连,最后将放大器的信号地连接在墙上交流插座的电源地(安全地)或单独的自埋接地线[3]。要避免出现多点接地,多点接地会在不同的接地点出现细微的电位差,从而在屏蔽层中产生电流形成地环路噪声。一旦出现环路,磁场就可能进一步增强这个环路的噪声。

1.3 磁感应噪声及其处理措施

当一个变化的磁通量切割一个环路线圈时,就会发生磁感应,并在线路中产生电流。这最有可能在电源的电磁铁的附近发生,并可以通过其波形来识别,其波形有非正弦的形状,频率是工频(50Hz)的高次谐波。将电源远离敏感电路可以削减这种噪声。如果这不可能,尝试使用双绞线以削减磁通量切割的面积,例如可以将放大器的信号地线与探头电缆构成双绞线。

2. 降低电学噪声的测试

2.1 初步处理

我们在HEKA-EPC9/10膜片钳记录系统中进行了测试。首先构造一个单点接地的“等电位系统”。准备一个多孔铜棒或多端子厚铜板做等“电位节点”,然后将屏蔽笼、Newport防震台金属板面、OlympusIX71显微镜体、Burleigh-PCS5200微操控制器和微操机架、MPS加药系统控制器和加药系统机架等设备的“机箱地”各通过一根(只能是一根)导线连接到等“电位节点”上。再将放大器的“信号地”通过一根导线连接到“等电位节点”上。我们对辐射噪声,磁感应噪声,地环路噪声进行了初步的处理。然后在该条件下对系统的噪声进行初步测试,测试条件见图1-1,数据见表1中Fig.1-1行。后两个噪声数据明显偏高。我们判断从周围环境中拾取在噪声仍是主要原因。屏蔽笼内的各个设备是独立的辐射源,由于迭加效应,会某些位置会出现辐射增强点。为了降低这些辐射点对电极工作位置(一般是样本上方,显微镜聚光镜下方)的影响,我们考虑在chamber和电极周围再放置第二层屏蔽。

2.2 加强局部屏蔽

第一步,阻挡来自chamber下方的噪声。利用显微镜上的某些扩展螺孔,将接地的屏蔽层延伸到chamber的下方,只保留足够的空间用于移动chamber。并用接地锡箔纸屏蔽环绕探头的输入端(图1-2)。对噪声的改善见表1中Fig.1-2行。第二步,为了消除来自chamber上方的干扰。用接地锡箔纸形成漏斗状,只保留一个孔通过照明光(图1-3)。对噪声的改善见表1中Fig.1-3行。第三步,我们将chamber的大部分位置用接地的锡箔纸包起来,以消除chamber周围的噪声,并将漏斗状锡箔纸拉低,形成了一个环绕样本的接地窗帘(图1-4)。对噪声的改善见表1中Fig.1-4行,噪声得到了明显的改善。


图 1.  探头噪声测试的优化过程。

1-1:起始探头位置;1-2,1-3:屏蔽来自chamber下方和上方的噪声;1-4:chamber被完全屏蔽。

表 1. 不同屏蔽条件下的噪声测试数据(单位:pA RMS)



2.3 定位屏蔽笼内的干扰源

当探头旋转到接地屏蔽窗帘的边缘时,离开局部屏蔽的保护,我们观察到噪声明显增加到1.2pA RMS,表明屏蔽笼内还存在较强的辐射源。屏蔽笼内的各种辅助设备,例如显微镜、微操、加药灌流系统、恒温系统,都是潜在的辐射源。这些辅助设备应该使用金属的机箱对其内部元件构成良好屏蔽,并且采用直流供电。使用交流供电的设备或功率较大的设备都应尽可能放置到屏蔽笼外面,或尽可能缩短电源线在屏蔽笼内的长度。虽然显微镜光源用是直流电源,但仍有相当可观的交流耦合。电源线中流动的电流强度变化或频率变化都会产生很明显的辐射噪声,因此只要可能,就应使用细金属网或锡箔纸等包裹电源线,形成一个附加的屏蔽层。灌流加药系统灌注溶液进入chamber的管子也需要屏蔽。从探头到主放大器的探头电缆,最好能再进行屏蔽,并且将放大器的信号地线与探头电缆构成双绞电缆。所有的信号线都应使用带屏蔽的BNC电缆,所有屏蔽层都必须导通以形成等电位点并最终连接到一个公共接地端子上。这些处理措施基本上可以消除主要的辐射干扰。

我们将探头作为一个探测天线,帮助检查屏蔽笼内的噪声分布和方向,发现接光电联合检测系统中的光电管方向辐射较大。在将光电管的壳体和电源线用锡箔纸包裹后,噪声从1.2pA RMS下降到0.57pA RMS。按照类似的方法,对整个系统进行了仔细的检查和充分屏蔽,噪声下降到0.215pA RMS。当探头回到局部屏蔽保护范围时,噪声则恢复到0.11pA RMS的水平。

2.4 讨论

在做局部屏蔽时,要注意避免出现多点接地。但在实际操作中,常常由于不清楚仪器内部的接地电路而导致多点接地。例如BNC的屏蔽层通常和仪器信号地互通,而不同仪器的信号地可能被连接在分离的电源地上。如果断开BNC屏蔽层或者断开某些电源地线,就可能消除环路。

在膜片钳系统中“接地端子”可以分成两种:一种是信号地(Signal GND):这一般由放大器提供,是放大器信号的0V参考点。另一种机箱地(Chassis GND):一般与整个机箱导通;有些设备上往往没有预先设置好的机箱地,这时可以选择机箱上某个裸露金属部分例如螺丝做接点。机箱地一般与三芯插座的“电源安全接地”互通。如果交流供电系统的“电源安全接地”是接大地的,则整个机箱也就接大地了。我们强调必须要检查供电系统的“安全地线”是否真正的接了大地。因为我们发现有些实验室的“电源安全接地”是悬空的,其他房间的强电设备如果也使用此悬空的“电源安全接地”,一旦强电设备漏电,就会对所有使用这个“安全地”的设备造成威胁。

3. 机械干扰分析及处理

在膜片钳系统中,导致电极尖端的机械震动和漂移是两种主要的机械干扰。

3.1 隔离系统震动

震动会直接导致封接失败和记录错误。引起震动或晃动主要是来自地面的垂直震动、空气流动和声波振动。具有良好缓冲性能的防震台可以有效隔离来自地面的垂直震动[2]。对于防震台上方的各种震动波动干扰,可以在屏蔽笼内部使用一层丙烯酸塑料环绕以阻断空气流动,并用填充泡末塑料,以消除声音振动的影响。如果实验室在地下室,或者选择半夜做实验,可以避免白天的许多震动来源。

3.2 防止系统漂移

在膜片钳实验中使用的记录微操必须坚固紧凑,其移动部分(包括微操、夹持器、电极尖端、chamber中的细胞)应尽可能短。微操应最好直接安装在显微镜加宽平台上。放大器探头应直接固定在微操上,要极力避免头重脚轻的结构,防止产生惯性震颤。美国Burleigh公司PCS5000/6000系列压电晶体微操和Sutter公司MP285系列马达微操性能都非常优良。而液压驱动的微操则由于液体的膨胀系数的缘故更容易发生漂移。在实验中,震动干扰往往容易察觉到并能及时消除。而对缓慢的电极尖端的漂移,则困难得多,往往要花很长时间来观察和判断[9]。漂移可定义为电极尖端相对细胞的移动,在高放大倍数物镜和CCD监视系统中可以观察到。引起电极漂移的原因可以是电极、探头、夹持器、微操、固定装置、显微镜体、显微镜平台,甚至细胞样本。一旦观察到漂移,需要反复观察判断,以定位漂移原因。根据我们对PCS5000和MP285微操的分析和实际使用经验,一般可按如下优先顺序检查:

3.2.1 检查温度变化情况和使用的材料。

温度是引起漂移的一个重要原因。例如将手掌靠近探头夹持器,手掌的温度就足以产生明显的漂移。因此我们要使系统避开例如空调出风口、窗户、日照,以及其他任何冷热源,使温度变化尽可能小。并且在与电极尖端位置有关的机械连接范围内避免使用温度敏感材料例如聚合材料。(部分物质的膨胀系数:石英玻璃0.56,硅酸盐玻璃3.2,不锈钢12,铝22)。石英玻璃的热稳定性最好[11]。铝也不错,它有高热导率,能快速散热。当使用同一种材料时,缓慢温度变化造成的膨胀是一致的,不至于产生明显的漂移。但在某些极端敏感的情况下,甚至需要用反光塑料来隔离实验人员的体温对系统的影响。

3.2.2 检查所有的机械连接。

我们可以抓住探头轻微尝试在所有方向上来回快速移动。如果手指感觉到细微的卡拉声,说明系统某处有松动。另一个测试是轻轻敲打显微镜并观察电极尖端,如果电极过分颤动,表明问题来自固定微操的平台。

3.2.3 检查探头和电极夹持器。

我们卸下探头,将玻璃电极直接固定在微操上,可检查电极尖端是否漂移。我们根据经验判断,大多数漂移都是探头和电极夹持器导致的。为了消除施加负压的胶皮管对夹持器的应力,需要选择尽可能软且轻的加胶皮管并固定在探头或悬挂以消除重力的影响。Axon公司早期的探头HL-1/2使用的是无螺纹固定的夹持器,固定依靠锥形特弗隆插头和插座的摩擦力,在多次使用后,摩擦引起特弗隆变形而使这种连接变得不稳定。Axon后来改进的HL-U,使用了螺纹连接,但旋上HL-U时切忌过分用力紧固,否则特弗隆螺纹的缓慢松弛会导致严重的漂移。HEKA公司的夹持器非常稳定。HEKA使用了一个优质BNC插头来固定夹持器到探头上。这种连接配合紧密,机械稳定性非常好。HEKA还加长了螺帽,并在螺帽中插入了一个圆柱,该圆柱可以精确引导和固定两个O型圈,以消除在夹持器内的电极移动。第三个在金属针尾端的O型圈可以防止整个夹持器相对BNC插座的移动,该设计还保证了当施加负压时,不会引起电极移动。

3.2.4 检查电缆的应力。

我们需要确保微操各个轴能够全程平滑移动,这可以检查微操驱动器是否工作正常,移动轴有没有阻碍。要保证所有电缆是自由放置的,没有给微操施加作用力。更换电极时,微操和探头电缆都有明显扭动,这会产生剩余应力,当这些应力慢慢释放时就会导致漂移。如果观察到的漂移在几分钟内有几个微米,漂移可能就来自电缆应力。我们可将微操电缆盘成柔软的大圈环,并使所有电缆在微操直线运动和旋转运动范围内都是松软的。在微操运行时,电缆不能被挤压拉伸。我们还可以将所有的电缆都垂直支持悬挂在微操的中心线上方,可以最小化应力。

4. 小结

本文主要讨论了膜片钳记录系统中的电学噪声和机械干扰问题。我们仔细分析了各种干扰的来源,并给出了许多有效的解决措施。这是我们近些年来安装调试多套HEKA和Axon系列膜片钳系统的经验总结。我们的分析结论和处理方法,对于国内许多膜片钳实验室进一步优化系统,具有参考价值。膜片钳单通道记录对低噪声、低震动和低漂移的要求是非常高的,因此本文对于常规电生理记录系统,也具有一定参考意义。

参 考 文 献

[1] E Neher ,B Sakman. The Patch Clamp Technique. Sci . Amer . ,1992 ,Mar :44 ~51

[2] Rivka Sherman-Gold,, The Axon Guide for Electrophysiology Techniques, Axon Instruments, Inc.,1993,19-23.

[3] 周专,康华光.膜片钳系统的噪声分析[J ] ; 中国生物医学工程学报,1992 ,11(2) :128 - 137.

[4] 康华光.细胞电生理与膜片钳技术[J ]; 中国医疗器械杂志, 2000, 24 (3) : 155- 160.

[5] 娄雪林,周专.康华光单通道和全细胞记录技术[J]; 中国医疗器械杂志, 2000, 24(4): 221- 226.

[6] Axon, Axopatch200B_manual_Rev_D, 2001, Specifications, 103-105.

[7] Axon, MultiClamp700B_manual_Rev_C, 2004, Specifications, 141-146.

[8] HEKA , Low-Noise Recording, Heka EPC10_manual, 2003, 66-68.

[9] Pipette Drift Sources and Solutions for Patch Clamp Recording Experiments, Burleigh Instruments , Inc. Application Note

[10] Richard A, Rae, JamesL, Low-Noise PatchClamp Techniques. Methods Enzymology. 1998, 293:218-266

[11] F.Sachs., A Low Drift Micromanipulator Holder, European Journal of Physiology 1995, 429:434-435.

 

(责任编辑:泉水)
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