海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术

军事医学科学院毒物药物研究所；北京 100850 刘振伟*；李立君；刘传缋

    关键词：海马脑片；盲法全细胞记录；膜片钳；离子通道；突触活动

    摘要：本文较为详细地介绍了海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术, 对其关键步骤和需要注意的问题进行了重点说明, 同时对CA1区锥体神经元突触活动的特点、电压门控性Ca2+通道以及谷氨酸(glutamate, Glu)、 γ-氨基丁酸(GABA)受体通道电流性质等进行了观察和分析。实验结果为采用海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术研究海马神经元离子通道动力学性质和中枢神经系统药物对突触活动的影响提供了可靠的依据。

    离体脑片的电生理研究始于20世纪50年代, 离体海马脑片标本由于具有有序的神经元和纤维排列以及完整的神经解剖通路等结构特点, 使其纤维和突触部位非常容易定位, 便于进行电生理技术操作。目前, 海马脑片已成为研究神经系统突触可塑性的良好标本; 另外, 海马是脑组织对缺氧最敏感的部位之一, 因此离体海马脑片得以广泛应用于缺氧机制的研究, 成为较理想的离体缺氧损伤模型[1,2]。

    膜片钳技术为德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann于1976年首创[3], 80年代以后此项技术得到广泛应用。而将膜片钳技术成熟地应用于离体脑片神经元则是1989年的事[4,5]。目前脑片膜片钳技术方法主要有两种: 一是可视法, 二是盲法。可视法是在显微镜直视下, 先用大开口的玻璃吸管将脑片表面的碎片残渣吹松动并吸走, 从而暴露单一神经元, 然后将玻璃微电极靠近神经元进行封接。这种方法要求脑片必须切得很薄, 以利于镜下操作的可视性, 同时要求有高质量体视显微镜和浸水物镜头。近年来, 发展了将红外微分干涉相差显微镜用于脑片膜片钳的方法, 其特点是同样要求脑片要薄, 且其直视效果更佳, 但其造价也非常高,国内一般的实验室尚不具备。盲法最早是Blanton等人[5]在海龟皮层脑片上采用的。其方法是在看不见神经元的情况下, 用玻璃微电极对脑片连续进行穿插直至遇到神经元, 然后进行封接。盲法对操作技术和实践经验要求较高, 但盲法的设备要求较为简单, 操作过程亦不复杂, 因此比较适合于国内实验室开展。目前国内离体脑片膜片钳技术开展的还不多, 本文结合我们的实验经验, 对海马脑片盲法膜片钳全细胞记录方法进行了较为详细的介绍。

    1. 海马脑片制备
选用出生20~30 d的健康Wistar大鼠, 乙醚麻醉下迅速断头取脑, 置于用氧混合气(95% O2+5% CO2)饱和的4℃人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)中冷却30 s。ACSF成分(mmol/L): NaCl 124、 KCl 3.3、 KH2PO4 1.2、 NaHCO3 26、 CaCl2 2.5、 MgSO4 1.2、葡萄糖 10 (pH 7.3)。然后取一侧大脑, 于大脑半球腹内侧分离出海马, 切断海马伞部, 仔细割断海马与大脑皮层的联系。将剥离出的海马头部切平, 平齐放在预先修整好槽沟的琼脂块上, 用滤纸吸干ACSF, 在海马平齐的头部与琼脂块底部涂上少许瞬间粘合剂(502胶), 然后一起垂直粘贴于振动切片机(MA752型, Campden Ins, UK)标本托上。在4℃和供氧混合气条件下, 用振动切片机将海马沿长轴顺横向的纤维走向切成厚为400 μm的薄片6~10片。将全部脑片置于氧混合气饱和的ACSF中, 室温下(20~25℃)孵育1 h待用。注意: (1) 剥离海马时要尽量去除盘绕在海马表面上的血丝, 以利于随后的切片过程; (2) 剥离时切勿挤压海马, 否则对制备出的海马脑片神经元活性影响极大。

    2. 盲法膜片钳全细胞记录

    2.1. 脑片固定目前脑片的固定方法多采用盖网固定法, 即用铂金丝制成一个U形或圆形框架, 然后将较稀疏的尼龙丝网附着其上, 制作成一个盖网轻覆于脑片上。也有学者采用纤维蛋白凝块固定法[5], 即将脑片放在少许血浆中, 用凝血酶使纤维蛋白原形成纤维蛋白而凝固的办法来固定脑片。我们在实验中摸索出采用鼠标垫制作的脑片垫固定脑片的效果不错。鼠标垫具有一定弹性并能在触压下与脑片附着, 转动脑片垫还可调节脑片在浴槽中的位置, 非常简单方便。具体做法为: 将孵育后的脑片移入脑片记录浴槽中。用尖镊子轻轻触压脑片边缘部位(如海马伞、下托等), 使脑片固定于记录浴槽底部用鼠标垫制作的脑片垫上以防止脑片漂动, 同时转动该垫以调节脑片在浴槽中的方位。用输液泵持续向脑片浴槽灌流氧混合气饱和的ACSF, 流速为1~2 ml/min, 脑片浸没于液面下约1~2 mm。整个实验在室温(20~25℃)下进行。

    2.2 细胞封接以无影灯为反射光源, 在解剖显微镜下, 海马脑片盲法全细胞记录技术的具体操作方法为: 调节微电极操纵器, 将带有正液压的记录用玻璃微电极置于海马脑片CA1区锥体细胞线上, 用微电极操纵器步进马达以2 μm/次的步幅沿细胞线方向纵向穿插。通过由膜片钳放大器(Axopatch-1D, Axon Ins, USA)输出到探头的去极化试验脉冲(20 mV), 在示波器(VC-9, Nihon Kohden, Japan)上监测封接情况。当遇到细胞时, 玻璃微电极的电阻增大, 试验脉冲方波会出现类似踩气球样的弹性变化, 此时改用负压吸引以高阻封接细胞, 最后通过膜片钳放大器电击(Zap)破膜形成全细胞记录。

    本实验记录电极选用软质玻璃毛坯, 经拉制仪(Sachs-Flaming PC-84, Sutter Ins, USA)拉制后抛光(MF-9, Narishige, Japan), 尖端直径为1~2 μm, 充灌电极内液后阻抗为2~5 MΩ。KCl电极内液成分(mmol/L): KCl 140、 HEPES 10、 EGTA 10 (pH 7.4)。将KCl换成KF即为KF电极内液, 用于记录GABA电流和sIPSC; 以CsCl 代KCl即为CsCl电极内液, 用于记录钙电流。

    2.3 电流采集与分析破膜后,首先进行串联电阻和膜电容补偿, 低通贝塞尔-3 dB滤波频率为2 kHz; 在记录电压门控性离子通道电流时, 漏电流采用pClamp软件(5.51版, Axon Ins, USA) P/N漏减方法[6]予以去除。所拾取的电流信号经TL-1接口导入计算机, 通过Clampex和Fetchex采样程序采入, 采样频率设为5 kHz。用6.02版的Clampfit、 Fetchan和pStat进行分析, 最后采用Origin 4.0数据处理软件(Microcal Software, USA)作图。

    2.4 给药方法Glutamate (Glu)、 GABA及GABAA受体激动剂异丙酚(propofol)通过压力注射仪(BH-2, Medical System, USA)施加, L型钙通道阻断剂戊脉胺(verapamil)和硝苯地平(nifedipine)通过ACSF灌流施加。

    3. 海马脑片CA1区锥体神经元自发突触活动

    采用KCl电极内液并将神经元膜钳制在-80 mV时, 可记录到自发兴奋性突触后电流(sEPSC); 而采用KF电极内液并将神经元膜钳制在-10 mV时, 可记录到外向的自发抑制性突触后电流(sIPSC), 它可被6 μg/ml GABAA受体激动剂异丙酚所增强(图2)。sEPSC和sIPSC均可被烟碱受体激动剂碘化二甲基苯基哌嗪(DMPP)所增强, 表明神经元烟碱受体可促进分别由递质Glu和GABA介导的自发突触活动(图3)。

    4.海马脑片CA1区锥体神经元离子通道电流

    4.1 电压门控性钙离子通道电流用ACSF中的河豚毒素(TTX)阻断钠通道, 用电极内液中的CsCl、四乙基铵(TEA), ACSF中的TEA和4-氨基吡啶(4-AP)阻断钾通道, 给予去极化脉冲, 即可记录到内向的钙电流(ICa) (图4)。Ca2+通道的激活阈电位偏低, 范围为-65~-30 mV, 平均在-50 mV左右。ICa的衰减具有ICa幅值的依赖性, ICa幅度越大, 其通道的衰减越快。同许多种类的细胞一样, 海马脑片锥体神经元ICa 亦有rundown现象, 记录10 min, 其幅度衰减约20%。根据ICa的上述特征以及其对戊脉胺(40 μmol/L)和硝苯地平(40 μmol/L)不敏感(未显示结果)等特点, 推测所记录的钙通道应为N型钙通道。

    4.2 配体门控性离子通道电流采用KCl电极内液, 将海马CA1区锥体神经元膜钳制在-80 mV, 用压力喷射仪给予100 μmol/L Glu时, 神经元会产生内向的Glu受体电流, 同时伴强烈sEPSC发放; 当采用KF电极内液, 将细胞钳制在-10 mV, 给予100 μmol/L GABA时, 可记录到外向的GABAA型受体电流, 此为Cl-内流, 同时伴强烈sIPSC发放。

    海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术操作步骤比较简单, 但由于是盲插, 无法看见神经元和看清微电极尖端, 加之微电极易于堵塞, 所以同可视法及培养、急性分散神经元全细胞记录方法相比, 要获得高效率的稳定封接存在相当的难度。据我们体会, 要形成高效率、稳定可靠的记录可借鉴以下几点经验: (1)选用鼠龄较小的大鼠(如出生20~30 d的大鼠)。鼠龄过大, 其神经元膜脆性大而弹性差, 会对神经元封接和破膜造成一定困难; (2) 进行脑片盲法全细胞记录时, 由于是盲插, 微电极尖端不能太细, 否则电极堵塞机率太高, 工作效率大大降低; (3)脑片穿插开始时, 第一次出现的电极阻抗增高往往是由于电极触到了脑片神经元碎片。此时可继续穿插, 阻抗一般可恢复; 如若不然, 用短促正压可吹去碎片, 继续进行穿插直至出现第二次电极阻抗增高, 此时很可能是遇到了神经元。如果仍形成不了封接, 应放弃而继续向脑片深层穿插, 做第三、第四次尝试; (4)如果采用负压吸引方式打破细胞膜, 所使用的吸力应较在分散和培养神经元上的为大, 否则不易打破细胞膜。(5)在脑片标本上, 负压吸引方式破膜往往会在破膜处遗留下膜的残片, 因而随着记录时间的推移, 常常会造成破口的关闭堵塞, 严重影响信号的记录, 而采用电击(zap)灼烧破膜的方法一般不易发生这种情况。

    按本文方法制备脑片和掌握上述几点经验, 均能记录到很好的全细胞电流, 总体成功率(高阻封接破膜并稳定维持5 min及以上的细胞数/穿插的细胞总数)约为80%。一般细胞记录时间稳定维持15 min以上不成问题, 可满足大多数体外实验需要。本实验结果为采用海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术进一步研究海马神经元离子通道的动力学性质和中枢神经系统药物对突触活动的影响提供了可靠的依据。

    参考文献

    [1] Liu ZW(刘振伟), Wang FZ (王福庄). Effects of hypoxia on area CA1 pyramidal neurons in rat hippocampal slices. Chin J Neurosci (中国神经科学杂志), 1994, 1(3):41~48 (Chinese, English abstract).

    [2]Tang JM (唐建民), Liu ZW (刘振伟), Ding AS (丁爱石) et al. Mechanisms of hypoxic injury potential in hippocampal slices. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1996, 12(2):165~169 (Chinese, English abstract).

    [3]Neher E, Sakmann B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers. Nature, 1976, 260:779~802.

    [4]Edwards FA, Konnerth A, Sakmann B et al. A thin slice pre~paration for patch-clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflügers Arch, 1989, 414:600~612.

    [5]Blanton MG, Lo Turco JJ, Kriegstein AR. Whole-cell re~cording from neurons in slices of reptilian and mammalian cerebral cortex. J Neurosci Meth, 1989, 30:203~210.

    [6]Liu ZW (刘振伟), Li LJ (李立君), Liu CG(刘传缋).Analysis of P/N leak subtraction of pClamp acquisition software. Acta Physiol Sin (生理学报), 2000, 52(5):440~443 (Chinese, English abstract). (军事医学科学院毒物药物研究所；北京 100850 刘振伟*；李立君；刘传缋) (责任编辑：泉水)

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