引言

　　所谓DNA重组就是将不同来源的DNA片段连接起来，构造新的基因型的过程。通常采用目的基因和质粒载体相连接的方法。可以采用几种策略来进行外源ＤＮＡ片段和质粒载体的连接。对此，可依据外源ＤＮＡ片段未的性质，以及质粒载体与外源ＤＮＡ上限制酶切位点的性质来作出选择。

（一）外源ＤＮＡ片段未的性质

带有各种未的外源ＤＮＡ的克隆方法见下表：

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外源ＤＮＡ片段
所带未端 　　　　　　　克隆的要求          　说明

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平端 　　　要求高浓度的ＤＮＡ和连接酶  1)非重组体克隆的背景可能较高
                       　            　2)质粒和外源DNA拼接处的限制酶切位点消失　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　                                       3)重组质粒会带人外源DNA的串联拷贝
不同末端   用两种限制酶消化后,需纯化  1)质粒与外源DNA拼接处的限制酶切位点可保留不同的突出端
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2)非重组体克隆的背景较低质粒体以尽量提高连接效率
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3)外源DNA只以一个方向插入到重组质粒中

粘性末端     相同突出端线状           1)质粒与外源DNA接合处限制酶切位点常可保留
　　　　　　 质粒DNA常用磷酸酶处理　  2)外源DNA会以两个方向插入
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3)重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝

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１．带有非互补突出端的片段

　　用两种不同的限制酶进行消化可以产生带有非互补突出端的片段。常用的大多数质粒载体均带有由几个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点。由于现有的多克隆位点如此多样，因而几乎总是能找到一种带有与外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位点的载体。于是，采用所谓的定向克隆即可将外源ＤＮＡ片段插入到载体当中。例如：载体pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ进行消化，然后，通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段，以使同切下来的多克隆位点缺小片段分开。于是，这一载体就可以同有与BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ区段相连接。用得到的环状重组体转化大肠杆菌，检查氨苄青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互补，载体片段不能有效地环化，所以转化大肠杆菌的效率也极低。因此，大多数具有氨苄青霉素抗性的细菌都含有带外源ＤＮＡ区段的质粒，外源ＤＮＡ区段成为连接HindⅢ和BamHI位点的桥梁。当然，可以根据特定的外源ＤＮＡ区段来改变限制酶的组合方式。
　　如要制备定向克隆载体，它尽量避免使用大多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点。这些位点中的一个被切开以后，第二个位点应位于线状ＤＮＡ分子一端的几个碱基对之内，这样过于靠近末端，不利于多种限制酶的有效切割。正因为如此，所以务必检查两种限制酶对载体的消化是否完全。可采用以下两种检查方法：１）用两种限制酶中的一种对载体进行消化，当所用限制酶的最适缓冲液对离子强度的要求有不同时，应使用所要求的盐浓度较低的酶。消化完后，应通过凝胶电泳对一小份ＤＮＡ进行检查。如所有质粒ＤＮＡ均从环状转变为线状分子时，适当调整盐浓度，并加入第二种酶。同时，另行设立一个预实验，其中含有环状质粒ＤＮＡ，并只加两种限制酶中的第二种。当预实验中的所有ＤＮＡ都转变为线状（由凝胶电泳确定）时，通过凝胶电泳或尺坟排阻凝胶层析纯化质粒ＤＮＡ大片段。\par ２）图1.7所示的是检查消化反应完全程度的一种更为严格的方法。对用第一个限制酶切割的一小份ＤＮＡ进行末端标记，经离尽柱层析法纯化后，与未标记的线状ＤＮＡ混合。然后用第二个酶消化，完全消化可使ＤＮＡ小片段释放，它应带有50％的放射性活度，这可通过层析或通过凝胶电泳和放射自显影加以检测。

２。带有相同末端（平端或粘端）的片段

　　带有相同末端（平端或粘端）的外源ＤＮＡ片段必须克隆到具有匹配末端的线状质粒载体中。在连接反应中，外源ＤＮＡ和质粒都可能发生环化，也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个ＤＮＡ的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平（见本节三）．此外，常常使用碱性磷酸酶去除5'磷酸基团以抑制质粒ＤＮＡ的自身连接和环化。在体外连接反应中，仅当一个核苷酸含5'磷酸基团而另一个含3'羟基时，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶可催化相邻核苷间形成磷酸二酯健。用细菌碱性磷酸酶(BAP)或牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去除线状ＤＮＡ两端的5'磷酸可以最大限度的地减少质粒ＤＮＡ区段可有效地与去磷酸化质粒ＤＮＡ相连接，产生一个含有两个切口的开环分子（图1.8）。因为环状ＤＮＡ（即使是带切口的环状ＤＮＡ）的转化效率比线状ＤＮＡ高得多，所以大多数转化体都含有重组质粒。

３．带有平端的片段

　　外源ＤＮＡ片段带平端时，还有一桩切外生枝的麻烦事，这就是平端的连接效率比起带有突出互补末端的ＤＮＡ要低得多。因此，涉及平端分子的连接反应所要求的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的浓度和外源及质粒ＤＮＡ的浓度都要高得多。还要说明的是，加入低浓度的如聚乙二醇一类的物质，常可提高这类反应的效率。

（二）质粒载体和外源ＤＮＡ中限制酶切位点的性质

　　如今，质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下，用切点位于多克隆序列侧翼的限制酶进行消化，可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源ＤＮＡ两端的限制酶切位点之间，不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决：
１）在线状质粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接头或衔接头。
２）在得到控制的反应条件下，用大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分补平带3'凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所讨论，这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端，从而促进载体和外源ＤＮＡ的连接。因为部分补平反应消除了同一分子两端彼此配对的能力，故连接反应过程中环化和自身寡聚化的机会也会有所降低（Hung和Wensink,1984;Zabarovsky和Allikmets,1986）。