自16世纪末罗伯特·胡克（Robert Hooke）发明第一台显微镜起，光学设备的革新就一直在推动生命科学的发展。能实时、实地看见生物体中最细微的动态变化一直是不少生物学家梦寐以求的“超能力”——而有了显微镜，这种能力将不再遥不可及。今年诺贝尔化学奖的得主之一，霍华德·休斯研究所的艾力克·贝齐格（Eric Betzig）和他带领的研究团队便是这样一群追梦人。

继2006年在《科学》上发表文章之后，研究小组于10月24日再次在《科学》上发表了他们的最新进展：新型晶格层光显微镜（lattice light-sheet microscope）在突破衍射极限的基础上，还能拍摄连续的高清动态3D视频——从细胞分裂时的骨架变化，到线虫发育的细节，细胞的“小动作”们在各种时空下一览无余。

2014年10月24日的《科学》封面：成像创新。图中为斑马鱼胚胎活体中的脑神经元成像。图片来源：Kai Wang, Eric Betzig, Janelia Research Campus; Jeff Mumm, Johns Hopkins University

要达到超越阿贝极限（0.2μm）的高分辨率，往往需要多束光由点及线再到面的细细雕琢；可是这么一来，研究者在获得清晰度的同时会牺牲时间和样品活力。说起拍摄“小电影”的工作难点，论文的第一作者，台湾应用科学研究中心的陈壁彰这样告诉果壳网科学人：“从二维到三维，在空间上重要的是轴向分辨率，在时间上则需要快，因为我们的观察对象是活体生物。”三维的景象是不同景深的二维图像拼接而成，拼接越紧凑，轴向的分辨率越高；而要想实时追踪活体样品的动态变化，必须尽可能压缩“拍照”和“叠加”的时间，与生物体赛跑。很长时间内，追求精度和追赶时间似乎无法两全。

先前，贝齐格发明的光激活定位显微镜（PALM）通过单次激发少量稀疏的荧光分子后迅速淬灭，绕过衍射极限，多次重复以获得高清图像。而赫尔（Stefan W. Hell）发明的另一种纳米显微镜，受激发射损耗（STED）显微镜则是在传统探照光束中加入了另一圈淬灭光束，以此提高精度。无论是哪一种，都免不了多束光对样品的长时间损耗——毕竟每张二维的图像都是由多个点扫描出的线拼接而成。要想加快速度，不仅需要更快的扫描速度，而且还得有更快的采集方式和数据处理方法。同时，扫描所用的激光也得更加柔和，以尽量减小对活体样品的损伤。

研究小组巧妙地利用了贝塞尔光束（Bessel beam）。与传统的高斯光束（Gaussian beam）不同，根据激光性质模拟出的贝塞尔光束不会发生衍射；同时，这样的光束能量更加分散，对样品更“温柔”。不过它也存在自己的问题。“（贝塞尔光束）并不只是一束光而已——它有周围这些暗一些的光圈，”贝齐格在一项访谈说，“于是，当它扫过样品时，你会得到散焦的光。”

晶格层光显微镜用非衍射性的贝塞尔光束（Bessel beam）取代以往的高斯光束（Gaussian beam），根据样品特性设计出不同的晶格（lattice），不仅更柔和，图像捕捉和处理的速度都大大加快。A、B分别为高斯光束和贝塞尔光束的光斑，C、D是两种不同的晶格，E、F、G是显微探头的工作示意图。在图G中，晶格层光（蓝绿色）与细胞（灰色）相交，在单一平面上激发出荧光（橙色）。层光扫过整个细胞，构建三维图像。图片来源：研究论文

为了克服这一点，研究小组利用了结构化照明（structured illumination）技术。通过事先设计好的照明结构，研究者们能够在后期通过计算程序抹去焦点外的“马赛克”。“有了这个技术，我们不仅能把副光圈产生的模糊像去掉，还能将分辨率进一步提升到衍射极限之外。”贝齐格说。

“在硬件上，我们需要激光光源，声光可调谐滤波器用来选择入射波长及能量，两组快速扫描镜，空间光调制器，两个光学镜头，一些不同焦距的透镜，及高速相机。而软件上，主要就是用labview来做所有的系统控制。声光可调谐滤波器会让所选择的波长及能量的激光通过，经过空间光调制器（上面有我们计算出的晶格样式），再经过透镜聚焦后，产生我们的衍射图样。”陈壁彰介绍说。这束图样经过光罩滤光，再由两个方向扫描镜将此相叠后便会在入射镜头处形成晶格层光。“这一薄层光照射在有荧光的生物样品上，发出的荧光会被另一个正相交的镜头收集，而所集的荧光就会成像在相机上。”

贝齐格曾表示：“一般来说，当人们做单分子研究时，他们需要将样品处理得非常薄，否则焦点外的光会毁了整个图像。”而晶格光片显微镜将这些限制也移除了。

“我们产生了一个非常薄层的光，就像纸一样，”陈壁彰对果壳网科学人说，“因为光层非常薄，所以能采到很高的轴向分辨率，取到的三维图像也愈接近真实的生物体。因为我们的光不是一直照射在样品上，所以对生物样品有低光损害，因此可以长时间观察这些活体生物，也就是四维的影像。”

模式生物嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila ）单个样品在8个连续时间点的三维图像。整套4D成像数据包括1250个时间点。图片来源：Betzig Lab，HHMI

有了这台功能强大的显微镜，研究小组通过与30组生物研究团队的合作，看见了许多前所未见的高清影像——例如，一个蛋白质在细胞内的三维动态，中性粒细胞在三维基质中动态“挤动”的细节，T细胞和靶细胞的“亲密接触”，还有线虫和果蝇胚胎发育过程中各种细胞的迁移和变化。

人早幼粒白血病细胞HL-60在胶原蛋白基质中迁移的影像。HL-60细胞表达带有mCherry荧光标记的utrophin蛋白（视频中绿色部分），胶原蛋白则带有FITC标记（视频中橙色部分），视频由超过250个个时间点数据构成，相邻两时间点间隔1.3秒。视频来源：Betzig Lab，HHMI

秀丽隐杆线虫胚胎在3折叠期时的快速肌肉抽动影像。视频中普列克底物蛋白同源结构域（PH domains）带有绿色荧光蛋白GFP标记，组蛋白带有红色荧光蛋白mCherry标记。比例尺为10微米。视频来源：Betzig Lab，HHMI

“这是我2011年秋天进入贝齐格实验室的研究题目，”回首项目攻坚过程，陈壁彰说，“老板当时已有电脑的理论计算的结果，只是如何将这理论的东西变成一个显微镜，甚至是生物的显微镜，都是未知的。一开始的确是遇到极大困难，我们试了很多种方法，也曾想放弃，后来给了自己最后两个月的时间，若做不出来就要放弃了。”

“那时的我每天和另一位同事，王凯，也是本篇论文的共同作者，并肩奋斗：他帮忙做计算，我来验证实验上的可行性。在2012年秋天，基本上的架构就已出来了。老板看到结果时相当开心，我们知道所有的东西都解开了。”陈壁彰回忆道。

“之后的一年多，就是做生物合作，因为老板告诉我说，生物显微镜就是给生物学家拿来应用的，不做生物合作要做什么？所以我们后来花了大部份的时间做生物。不过同时我也一直在加强显微镜的功能。”陈壁彰说。

功夫不负有心人，这台显微镜给生命科学带来了惊喜和震撼。而研究小组的追梦步伐不会就此止步。“我们目前的主要生物对象是细胞，线虫的卵或是生物体较表面的东西，”陈壁彰告诉果壳网科学人，“所以如何将所看的东西往更大的方向走，就是我们未来的工作方向。我们就是要看得快、看得小、看得久、看得深。”晶格层光显微镜不会成为登峰造极之作，因为未来只会更好。“未来的我想借由非线性光学往‘看得深’及‘看得快’的方向前进。”（编辑：Calo）

参考文献：

1. Bi-Chang Chen, et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science: 346 (6208)

文章题图：Kai Wang, Eric Betzig, Janelia Research Campus; Jeff Mumm, Johns Hopkins University