抑郁症作为一种常见的精神疾病，具有高致残率等危害，其微观发生机制是当前研究的领域之一。近期对于抑郁症病因的研究突破了表型和遗传异质性的限制，在识别可复制的遗传风险位点方面取得了第一个全基因组的重大结果即确定了两种导致重度抑郁症风险的基因变异，其中一种是sirtuin 1 (SIRT1)。SIRT1基因与抑郁症之间的联系也已被其他基因分析证实，SIRT1是NAD(+)依赖的去乙酰化酶，属于III类组蛋白去乙酰化酶。其功能是去乙酰化组蛋白、影响基因表达的表观遗传学，此外，它调节特定转录因子和酶/蛋白的乙酰化，从而调节它们的功能。

本研究中，Lu团队发现在前脑谷氨酸能神经元中条件性敲除SIRT1的小鼠表现出一种性别特异性的抑郁样表型，并伴有内侧前额叶皮层(mPFC)锥体神经元兴奋性降低和自发兴奋性突触传递。虽然在成年小鼠的mPFC中选择性地敲低SIRT1会导致抑郁行为，但在该区域激活SIRT1足以逆转慢性应激引起的抑郁行为。研究结果表明，前脑兴奋性神经元中的SIRT1是抑郁相关行为的重要调节因子，也是mPFC锥体神经元突触传递和兴奋性的调节因子。

结果：

1. 小鼠前脑兴奋性神经元中SIRT1的缺失

为了确定SIRT1在前脑兴奋性神经元中的功能，通过SIRT1flox/flox小鼠与Emx1-ires-Cre小鼠交配制备模型小鼠。将SIRT1flox/flox小鼠作为对照鼠，将同时具有floxed等位基因和Cre转基因的SIRT1Emx1-KO小鼠作为模型鼠，且该小鼠中Emx1 -cre介导的SIRT1缺失最可能发生在兴奋性神经元而不是胶质细胞中。实时荧光定量PCR检测SIRT1第4外显子mPFC和海马中的敲除情况，下丘脑中表达水平保持不变。

由于SIRT1与海马、前额叶皮质均与饮食、能量等有关，Lu课题组检测了SIRT1缺失小鼠的体质量与摄食情况。SIRT1Emx1-KO的雌性与雄性小鼠的体质量均正常，在摄食行为方面， SIRT1Emx1-KO与对照小鼠之间没有显著差异。

2. SIRT1敲除的雄性而非雌性小鼠出现抑郁样表型

为了确定前脑兴奋性神经元中的SIRT1失活是否影响抑郁相关行为，对小鼠进行了一系列行为学检测。采用无热量的蔗糖进行糖水偏好实验，结果显示与对照组相比，雄性SIRT1Emx1-KO小鼠糖水偏好显著降低。雌性小鼠的糖水偏好未发生改变。雄性SIRT1Emx1-KO强迫游泳中悬浮不动时间明显增加。两个实验表明损失皮质和海马兴奋性神经元中的SIRT1会导致性别差异的快感缺乏症和绝望性行为表现型。另外，在排除小鼠自发运动能力的影响后的旷场箱结果显示两组小鼠之间均无显著性差异，用暴露于不可避免的休克应激后的习得性无助范式对小鼠进行了测试，两组小鼠的逃避潜伏期无显著性差异。

3. 腺病毒介导的成年雄性小鼠前额叶皮质SIRT1的敲低会引发抑郁样行为

为了验证前额叶皮质中的SIRT1对抑郁样行为的影响，采用双侧注射AAV-Cre-GFP至SIRT1flox/flox小鼠前额叶皮质的方法实现在前额叶皮质特异性敲低SIRT1，并在三周后检测了前额叶皮质中SIRT1敲低的效果。通过雌性小鼠尿液取样测试、糖水偏好测试、强迫游泳实验及旷场实验对处理前后的小鼠进行行为学检测，结果显示：与正常组相比，注射AAV-Cre-GFP的小鼠用更少的时间嗅探雌性小鼠的尿液，对于纯水及雄性尿液的嗅探没有差异，糖水偏好系数下降。这些结果表明，SIRT1的消融导致了一种快感缺乏症表型，在奖赏相关行为的完成性和动机性方面都存在缺陷。注射AAV-Cre-GFP小鼠强迫游泳悬浮不动时间延长，提示了一种抑郁样的行为表型。

4. SIRT1的敲低会降低前缘内侧前额叶皮质第V层锥体神经元的神经元兴奋性及兴奋性突触传递

前额叶皮质第V层锥体神经元在调节抑郁样行为中发挥重要作用，为了探索雄性SIRT1Emx1-KO小鼠与mPFC层V锥体神经元内部神经元兴奋性和兴奋性突触传递的改变课题组进行了一系列实验。首先通过免疫组化方法确定缘前与缘下皮层中SIRT1的表达情况，由于这两个部分具有相反的作用，通过全细胞膜片钳的方法分别记录了第五层锥体神经元的活动。

5. 前额叶皮质缘前皮层第V层锥体神经元

为了评估脑区内在的兴奋性，课题组在电流钳模式下分析了缘前皮层mPFC中V层锥体神经元对去极化电流注入的放电反应。结果显示，SIRT1Emx1-KO小鼠的神经元产生的动作电位（APs）比对照组小鼠少，引起AP的最小注入电流较对照组小鼠明显增加，其他输入阻抗以及电流注入引起的第一个动作电位的相关参数均没有差异。

为了确定SIRT1缺失对V层锥体神经元兴奋性突触传递的影响，我们记录了自发的兴奋性突触后电位（sEPSCs），结果显示SIRT1Emx1-KO小鼠的幅值与频率均较对照组降低。为了确定sEPSCs与AP的关系，在使用TTX干预后记录两组小鼠的mEPSCs,结果显示组间没有差异。

6. 前额叶皮质缘下皮层第V层锥体神经元

对缘下皮层V层锥体神经元进行类似的电生理记录。结果显示其不受SIRT1缺失的影响。接下来我们记录并分析了边缘区下mPFC V层锥体神经元中的sEPSCs，其平均振幅和频率均无显著差异。

7. SIRT1缺失会损伤前额叶皮质神经元的线粒体发生

我们研究了mPFC神经元中SIRT1缺失对线粒体机制的影响，接下来，我们测定mPFC亚区域中参与线粒体生物发生和动力学的特定基因的表达水平，线粒体生物发生的主要调控因子PGC-1α的mRNA表达水平在缘前皮层显著降低。另外，我们检测了介导线粒体融合的基因，包括丝裂蛋白1 (MFN1)和MFN2，以及线粒体裂变，包括裂变1 (FIS1)和动态相关蛋白(Drp1)的表达水平。结果表明缘前皮层中的SIRT1是线粒体生物发生与动力学相关的基因正常表达所必需的。

8. 激活SIRT1会逆转CUS引起的抑郁样行为

下一步课题组探索了是否特异性激活mPFC缘前皮层中的SIRT1，足以逆转慢性应激引起的抑郁行为。小鼠前额叶皮质插管后暴露于慢性不可预知应激（CUS）环境中，在行为测试前接受三次双侧注射SIRT1 激动剂SRT2104或生理盐水。结果显示，CUS会降低糖水偏好并增加强迫游泳中悬浮不动时间，这种效应可被缘前皮层注射SRT2104逆转。考虑到SIRT1在大脑不同区域的相反作用，通过糖水偏好实验和强迫游泳实验检验了脑立体定位注射SRT2104治疗CUS诱导的抑郁相关的效应。

这些结果表明mPFC神经元中SIRT1的活性是与性别特异性抑郁行为相关的关键调节器。mPFC缘前皮层锥体神经元SIRT1的活性异常及神经元兴奋性受损会促进抑郁症的发展，从而为抑郁症治疗提供新的靶点选择。

涉及的行为学：

糖精/糖水偏好测试

实验前，小鼠习惯饮用两个瓶子的水1周。小鼠可以自由选择饮用0.01%的糖精溶液或白开水。一个计算机化的舔度计连接到一个装有两个瓶子的操作室，用来测定老鼠对甜味溶液的享乐反应。小鼠习惯于操作室和剥夺水过夜。研究人员让老鼠在糖精溶液和舔痕计之间进行选择，舔痕计记录了老鼠舔每个吸管的次数。这种偏好的计算方法是，舔糖精吸管的次数除以舔所有吸管的总次数乘以100。在笼中也测量了糖精/蔗糖的偏好。老鼠可以在一个瓶子里自由选择糖精(0.01%)或蔗糖(1%)溶液和一个水瓶。测量水和糖精/蔗糖的摄入量，通过消耗糖精溶液的质量除以液体摄入的总质量计算出对糖精或蔗糖的偏好。

雌性尿嗅探试验

这是一种非操作性测试，目的是评估与性相关的奖赏寻求行为，依据是雄性啮齿动物对发情期雌性尿液中的信息素气味的兴趣。将雄性小鼠置于以下测试程序:(1)浸泡棉签3分钟;(2)一段45分钟时间间隔;(3)用发情期雌鼠新鲜尿液浸泡棉签3分钟;(4)间隔45分钟;(5)将棉签浸泡在雄性小鼠的新鲜尿液中3分钟。对雌性尿嗅探时间进行评分。

强迫游泳测试

小鼠被放置在一个透明的树脂玻璃缸中(高25厘米;直径10厘米)，装满24°C的水，深度15厘米。在圆柱体的正上方安装一个电荷耦合器件(CCD)摄像机，记录每只小鼠6分钟的行为。测量最后4分钟的静止时间。静止的定义是除了呼吸引起的肢体或身体没有任何运动。

自发活动

小鼠被放置在开放式旷场箱中，允许在照明条件下自由探索30分钟。老鼠的运动由安装在笼子上的红外光传感器监测，通过Fusion软件分析行走的总距离。

习得性无助实验

习得性无助性测试是在一个梭形笼子中进行的，笼子被平均分为两个房间，两个房间之间有一个自动控制的门。小鼠在1小时内接受200次不可避免的脚部冲击(0.3 mA的冲击幅度，2秒的持续时间，16秒的平均间隔)。连续2天诱导习得性无助，在同一穿梭箱最后一次训练后24小时进行逃脱性能测试。每只小鼠进行30次穿梭箱逃离试验，最大持续时间为25秒，间隔时间为30秒。在前五次试验中，当门打开时，一个声音提示和震动同时发生。在剩下的试验中，门在电击2秒后打开。每次试验在小鼠进入非刺激室时终止。在测试过程中，每个试验的逃避潜伏期由软件自动记录。

原文链接：http://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30705425

山东中医药大学 中医药与脑科学研究创新团队 刘坤供稿